親和層析原理和步驟

1、親 和 層 析Affinity Chromatography,一、原理,親和層析是利用生物大分子所具有的專一親和力而設計的純化技術(shù) 尋找配基配基固定化制成親和層析柱,基本過程,固相化,,,,吸附,解吸,,載體,,,,酶： 基質(zhì)類似物，抑制劑，輔酶抗體： 抗原，病毒，細胞細胞： 細胞表面特異蛋白，外源凝集素核酸： 互補堿基序列，組蛋白，核酸聚

2、合酶 激素或藥物： 受體，載體蛋白外源凝集素： 多糖，糖蛋白，細胞表面受體，細胞,常見具有專一性親和力的生物分子對：,（一） 載體的選擇,1、載體要求：（1）不溶性（2）滲透性：疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有良好的液 體流動性（3）化學和機械性能穩(wěn)定（4）具備大量能被活化的基因（5）抗微生物和酶的侵蝕,2、常用載體（1）纖維素 特點：價廉、來源充足 纖維性、非均一性限制大分子

3、的摻入 非專一性吸附嚴重 用于抗體和酶的純化,（2）葡聚糖凝膠特點： 化學及物理性質(zhì)穩(wěn)定 多孔性比瓊脂糖低,（3）瓊脂糖凝膠,濃度 商品2% Sepharose 2B 4% Sepharose 4B 6% Sepharose 6B,凝膠濃度越低結(jié)構(gòu)越疏松機械強度越低,（4）聚丙烯酰胺凝膠,（5）多孔玻璃特點：不受微生物的侵蝕

4、 耐酸、堿、有機溶劑 表面非專一性吸附,特點：物理化學性質(zhì)穩(wěn)定 抗微生物侵蝕能力比瓊脂糖強 可供化學反應的酰胺基較多,（二）配基的選擇,1、對于欲純化的物質(zhì)應有專一親和力2、必須具備能被修飾的功能基團,以酶和底物為例：,E+L ELKL =[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL]E0、L0：起始濃度當L0》E

5、0時KL =[E0-EL][L0]/[EL][EL]=[E0-EL][L0]/ KLKd=結(jié)合酶/游離酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/ KL,,KL,,KL：解離常數(shù) E： 酶 L： 底物EL：復合物,（三）固相化——將配體以共價鍵連接于固相基質(zhì)上制成固相化吸附劑,載體的排斥效應載體的空間障礙,二、親和層析分離,1、裝柱和平衡2、上樣、親和吸附3、洗脫,,,,,,,無效洗脫,吸附效率不高,有效吸附,,,,,,

6、,洗脫方法（1）非特異性洗脫：改變洗脫液pH值離子強度梯度洗脫（2）特殊洗脫：當?shù)鞍孜骄o密或上述方法洗脫會引起失活，可用專一的化學方法裂解配基與載體的連接鍵，再用透析或凝膠層析法去除配基。 斷鍵方法：硫酯鍵、偶氮鍵、二硫鍵（3）專一性洗脫,已使用過和柱，經(jīng)過再生處理，去除非特異吸附的雜質(zhì)后，可重復使用 再生步驟：起始緩沖液重復平衡一次用高離子強度和低離子強度溶液處理用弱酸或弱堿溶液處理,4、親和柱的再生：