呋喃唑酮代謝物AOZ免疫磁珠、免疫親和層析柱的研制.pdf

1、獸藥在現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮著十分重要的作用，但近年來，一些養(yǎng)殖人員或企業(yè)為了節(jié)約成本、獲得較高抗菌效果而不顧國家規(guī)定濫用抗菌藥物甚至使用禁用獸藥，造成了動物源性食品中獸藥的殘留，嚴重威脅人類健康和自然環(huán)境。雖然硝基呋喃類藥物屬于廣譜抗菌藥，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有抑菌、殺菌作用，但研究發(fā)現(xiàn)該類藥物均具有致癌、致突變、致畸毒性，因此各國已將其列為禁用獸藥。呋喃唑酮是硝基呋喃類藥物中常用的一種，其代謝物3-氨基-2-噁唑烷酮（3-

2、amino-2-oxazolidinone，AOZ）具有強烈的致癌、致突變作用，目前國內(nèi)外用于檢測呋喃唑酮殘留的方法多為儀器分析法和免疫分析法。為了提高靈敏度、減少基質干擾、縮短樣品前處理時間，本試驗主要通過制備AOZ單克隆抗體，與納米磁珠、瓊脂糖凝膠偶聯(lián)，制成AOZ免疫磁珠、AOZ免疫親和層析柱，并優(yōu)化各自吸附、洗脫條件，最終應用于雞肉樣品前處理中富集凈化AOZ的衍生物3-[[（4-硝基苯基）-亞甲基]-氨基]-2-噁唑烷酮(NPAO

3、Z)，經(jīng)間接競爭ELISA測定最低檢測限和回收率以確定免疫磁珠和免疫親和層析柱的使用性能。
　　試驗Ⅰ AOZ單克隆抗體的制備及鑒定
　　采用活化酯法將CPAOZ與BSA偶聯(lián)制成免疫原免疫小鼠，第四次免疫后取最佳免疫小鼠脾細胞與SP2/0細胞進行融合，通過間接ELISA和間接競爭ELISA方法篩選出分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株，并進行亞克隆與凍存。于小鼠腹腔接種細胞后，收集的腹水即為AOZ單克隆抗體，對其進行特性分析得出:該

4、AOZ單抗的效價為1∶100萬，對NPAOZ的半數(shù)抑制濃度為0.31 ng/mL;利用間接競爭ELISA法對四種硝基呋喃類藥物代謝物的衍生物（NPAOZ、NPAMOZ、NPAHD、NPSEM）以及對硝基苯甲醛、對醛基苯甲酸進行交叉抑制試驗發(fā)現(xiàn)，AOZ單抗只與NPAOZ有反應，而與其它藥物均無交叉反應。表明本試驗制得的AOZ單克隆抗體具有高效價、高靈敏度、高特異性的特點。
　　試驗Ⅱ AOZ免疫磁珠的研制
　　先將納米磁珠經(jīng)E

5、DC和NHS活化，并與AOZ單克隆抗體偶聯(lián)制成AOZ免疫磁珠，對該磁珠的上樣、洗脫條件進行優(yōu)化，最終應用于雞肉樣品前處理中，并利用間接競爭ELISA法進行加標回收試驗。結果表明，1 mg納米磁珠活化后可與50μg AOZ單克隆抗體偶聯(lián);在樣品液pH值為7條件下，上樣吸附10 min，磁珠對NPAOZ可保持較高吸附率;用300μL純甲醇洗脫磁珠5 min，可將NPAOZ順利洗下;AOZ免疫磁珠只對NPAOZ具有較高的特異性吸附，而對NPA

6、HD、NPSEM、NPAMOZ均無吸附作用，該免疫磁珠重復使用兩次后對NPAOZ的吸附率仍有86.5％。加標回收試驗結果表明，加標量為0.25～2 ng/g時回收率均在78％以上，變異系數(shù)為5.3％～10.9％，最低檢測限為0.049μg/kg遠低于常規(guī)樣品前處理法的最低檢測限0.139μg/kg，說明基于免疫磁珠的樣品前處理方法能有效富集雞肉中NPAOZ，并有效提高了ELISA檢測方法的靈敏度。
　　試驗Ⅲ AOZ免疫親和層析柱

7、的研制
　　將AOZ單克隆抗體偶聯(lián)至CNBr活化的SepharoseTM4B膠上制成AOZ免疫親和層析柱，優(yōu)化層析柱的上樣、洗脫條件，確定其柱容量和重復使用次數(shù)，最終應用于雞肉樣品前處理過程中富集NPAOZ，通過間接競爭ELISA方法測定AOZ回收率以及該方法的靈敏度。試驗結果表明，當上樣液pH為7.0，并以2 mL/min流速上樣時，NPAOZ的吸附率大于90％，而用6 mL90％甲醇水溶液以3 mL/min速度洗脫層析柱時，可