層析介質(zhì)孔徑與配基密度對(duì)蛋白吸附性能影響及抗體分離研究.pdf

1、層析是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白分離方法，介質(zhì)性能決定了層析分離過程的效率，關(guān)注點(diǎn)常集中于介質(zhì)偶聯(lián)的功能配基，而孔徑和配基密度往往被忽視。本文以抗體分離為目標(biāo)，探討兩種不同作用機(jī)制的層析方法，離子交換層析和疏水電荷誘導(dǎo)層析，制備不同配基密度與孔徑的系列介質(zhì)，比較吸附性能，分析配基密度與孔徑的影響。主要結(jié)果如下:
　　以3種不同孔徑的瓊脂糖凝膠（Bestarose3.5HF、4FF和6FF）為基質(zhì)，優(yōu)化配基偶聯(lián)條件，制備了不同配基密度的陰

2、離子交換層析介質(zhì)（以diethylaminoethyl，DEAE為配基）和疏水電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)（以2-mercapto-1-methylimidazole，MMI為配基）。對(duì)于DEAE介質(zhì)，最高配基密度分別達(dá)到110、280和410μmol/g;對(duì)于MMI介質(zhì)，分別達(dá)到50、110和130μmol/g。
　　以牛免疫球蛋白(bIgG)和牛血清白蛋白(BSA)為模型蛋白，考察了系列DEAE介質(zhì)和MMI介質(zhì)的靜態(tài)吸附性能，并采用Lan

3、gmuir吸附等溫式進(jìn)行擬合。結(jié)果表明，對(duì)于DEAE介質(zhì)，配基密度較低時(shí)，增加配基密度有利于蛋白質(zhì)吸附;密度較高時(shí)，吸附量趨于穩(wěn)定，甚至略有降低;較小孔徑介質(zhì)的比表面積較大，有利于蛋白質(zhì)吸附;綜合考慮孔徑和配基密度影響，提出綜合參數(shù)N，發(fā)現(xiàn)兩種蛋白的飽和吸附容量均隨log(N)呈線性變化。對(duì)于MMI介質(zhì)，配基密度較低時(shí)，MMI介質(zhì)無法有效吸附BSA和bIgG;當(dāng)單位表面的配基數(shù)目較高（＞15×10-12μmol/μm2）時(shí)，介質(zhì)才能較好

4、吸附BSA和bIgG。
　　考察了系列DEAE介質(zhì)和MMI介質(zhì)對(duì)bIgG和BSA的動(dòng)態(tài)吸附性能，包括吸附動(dòng)力學(xué)和穿透曲線。采用孔擴(kuò)散模型對(duì)吸附動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行擬合，對(duì)于DEAE介質(zhì)，配基密度對(duì)有效擴(kuò)散系數(shù)的影響不大，而孔徑增大可促進(jìn)孔內(nèi)擴(kuò)散;對(duì)于MMI介質(zhì)，配基密度和孔徑增大都可促進(jìn)蛋白質(zhì)的孔內(nèi)擴(kuò)散，主要原因在于提高了介質(zhì)與蛋白之間的疏水作用力。根據(jù)穿透曲線獲得蛋白的動(dòng)態(tài)載量Q10％，系列DEAE介質(zhì)對(duì)BSA動(dòng)態(tài)載量都比較大，總體上

5、隨平衡吸附量而線性增大;而bIgG動(dòng)態(tài)載量達(dá)到最大值時(shí)的配基密度有所偏移，分析可能原因在于動(dòng)態(tài)吸附過程降低了bIgG在介質(zhì)內(nèi)部孔道的可及區(qū)域，減小了介質(zhì)內(nèi)部能夠與蛋白相互作用的有效配基。MMI介質(zhì)對(duì)BSA的動(dòng)態(tài)載量很小，對(duì)bIgG的動(dòng)態(tài)載量則依賴于介質(zhì)的配基密度和孔徑，控制較低操作流速，配基密度較高、中等孔徑的MMI-B-4FF-110介質(zhì)可實(shí)現(xiàn)bIgG的高效吸附。
　　考察了三種MMI介質(zhì)MMI-B-3.5HF-50、MMI-B

6、-4FF-110、 MMI-B-6FF-110對(duì)bIgG和BSA混合蛋白的吸附等溫線，發(fā)現(xiàn)吸附過程存在競(jìng)爭(zhēng)性，具有優(yōu)先吸附bIgG的能力，其中孔徑適中、配基密度較大的MMI-B-4FF-110介質(zhì)最佳，對(duì)bIgG的飽和吸附容量為93.51 mg/g，而對(duì)BSA僅為43.69mg/g。進(jìn)一步考察了MMI-B-4FF-110對(duì)混合蛋白的吸附動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)BSA對(duì)bIgG的動(dòng)態(tài)吸附影響不大，而當(dāng)bIgG存在時(shí)改變了MMI介質(zhì)對(duì)BSA的吸附，MM

7、I對(duì)BSA的吸附量在吸附初始階段大于其平衡吸附容量，隨后逐漸減小到其平衡吸附量，可能是介質(zhì)對(duì)兩種蛋白吸附作用的強(qiáng)弱差異造成。
　　以bIgG為分離目標(biāo)，考察了MMI介質(zhì)的分離性能，包括bIgG/BSA混合液中分離bIgG，以及牛血中分離bIgG。對(duì)于bIgG/BSA混合液，優(yōu)化了層析分離的上樣和洗脫條件，確定pH7.0上樣和pH4.0洗脫，可以獲得高純度的bIgG;比較了不同配基密度和孔徑的MMI介質(zhì)，發(fā)現(xiàn)孔徑適中、配基密度較大的

8、MMI-B-4FF-110介質(zhì)效果最好。進(jìn)一步采用優(yōu)化的分離條件，利用MMI-B-4FF-110從牛血中分離bIgG，結(jié)果表明，牛血經(jīng)離心和硫酸銨沉淀預(yù)處理后，利用MMI介質(zhì)一步層析分離，bIgG純度約95％，收率大于85％。
　　本文以DEAE離子交換層析為常規(guī)層析的典型代表，MMI疏水性電荷誘導(dǎo)層析為新型分離方法代表，系統(tǒng)考察了介質(zhì)孔徑和配基密度對(duì)bIgG和BSA吸附性能的影響，得到一些規(guī)律性認(rèn)識(shí)，并且發(fā)現(xiàn)MMI介質(zhì)對(duì)bIgG