聚合物接枝型疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)設(shè)計(jì)及蛋白質(zhì)吸附機(jī)理研究.pdf

1、疏水性電荷誘導(dǎo)層析(Hydrophobic charge-induction chromatography，HCIC)是一種新型抗體分離技術(shù)，其配基兼有疏水、靜電、氫鍵等多種相互作用，具有選擇性好、耐鹽性高、洗脫條件溫和以及價(jià)格相對低廉等特點(diǎn)，已有一些成功應(yīng)用實(shí)例。由于配基與抗體結(jié)合力較弱，使得HCIC介質(zhì)在高流速下對抗體的動態(tài)結(jié)合載量較低，而聚合物接枝的離子交換層析介質(zhì)可以顯著提高蛋白的吸附容量、傳質(zhì)速率和動態(tài)結(jié)合載量。因此本文以高效

2、抗體分離為目標(biāo)，設(shè)計(jì)并制備了兩種聚合物接枝型HCIC介質(zhì)，比較蛋白吸附和傳質(zhì)性能，分析層析過程的固相條件（聚合物接枝、配基密度、接枝密度）和液相條件（pH和添加鹽）的影響，并借助逆體積排阻層析(Inverse size exclusion chromatography，ISEC)、等溫滴定量熱儀(Isothermaltitration calorimetry，ITC)和共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal laser scanning

3、microscopy，CLSM)進(jìn)行了微觀分析，以指導(dǎo)新型介質(zhì)設(shè)計(jì)。主要結(jié)果如下:
　　首先以葡聚糖接枝的瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，以2-巰甲基咪唑(MMI)為配基，優(yōu)化了配基偶聯(lián)條件，制備了不同配基密度的葡聚糖接枝MMI介質(zhì)。相比非接枝MMI介質(zhì)，配基密度提高了50％左右，達(dá)到200μmol/g。以hIgG為模型蛋白，考察了系列葡聚糖接枝MMI介質(zhì)的靜態(tài)吸附、吸附動力學(xué)和層析柱動態(tài)吸附性能。結(jié)果表明，在近中性pH下，葡聚糖接枝介質(zhì)對蛋白

4、的吸附容量、結(jié)合力、傳質(zhì)速率和動態(tài)結(jié)合載量隨著配基密度增加而持續(xù)增加，葡聚糖接枝MMI介質(zhì)相比非接枝MMI介質(zhì)具有更高的蛋白吸附容量、傳質(zhì)速率和動態(tài)結(jié)合載量。在pH7.0～8.9時(shí)，飽和吸附容量保持在107.5～110.0 mg/g，受pH影響較小;在100 cm/h線性流速下hIgG動態(tài)結(jié)合載量達(dá)到38.3 mg/g;在弱酸性條件下，葡聚糖接枝MMI介質(zhì)的蛋白吸附容量和傳質(zhì)速率下降更顯著，有利于蛋白解吸。此外，葡聚糖接枝MMI介質(zhì)吸附

5、能力受鹽濃度的影響較小，但傳質(zhì)速率受鹽濃度的影響較大。
　　其次，針對葡聚糖接枝介質(zhì)中HCIC配基同時(shí)存在于接枝層和基質(zhì)孔道表面上的局限，利用表面引發(fā)的電子轉(zhuǎn)移再生活化劑的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)，制備了不同接枝密度和配基密度的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)接枝MMI介質(zhì)。結(jié)果表明，高接枝密度和中等配基密度的聚GMA接枝MMI介質(zhì)對hIgG具有更高的飽和吸附容量和傳質(zhì)速率。相比葡聚糖接枝MMI介質(zhì)以及商業(yè)化HCIC介質(zhì)MEPHyp

6、erCel，聚GMA接枝介質(zhì)對hIgG具有更高動態(tài)結(jié)合載量。hIgG動態(tài)結(jié)合載量受流速影響較小，線性流速300 cm/h下可達(dá)34.6 mg/g，且具有明顯的pH依賴吸附和耐鹽吸附特性。此外，考察了從混合蛋白體系（hIgG/HSA=1∶4）中分離hIgG和從CHO細(xì)胞培養(yǎng)液中分離單克隆抗體，聚GMA接枝HCIC介質(zhì)均表現(xiàn)出良好的抗體分離和重復(fù)使用性能，50個(gè)周期循環(huán)使用的抗體純度和收率分別穩(wěn)定在98.5～99.8％和90.2～96.9％

7、。
　　最后，為了從微觀尺度揭示聚合物接枝MMI介質(zhì)的吸附及傳質(zhì)機(jī)制，利用ISEC考察了介質(zhì)孔結(jié)構(gòu)的影響，利用ITC研究了不同蛋白（hIgG和BSA）的吸附熱，利用CLSM實(shí)時(shí)觀測了單個(gè)介質(zhì)顆粒內(nèi)蛋白的吸附、傳質(zhì)及洗脫過程。ISEC結(jié)果表明，不加鹽時(shí)葡聚糖接枝鏈和聚GMA接枝鏈在基質(zhì)表面形成三維空間分布，有助于提高蛋白吸附容量;高鹽濃度下，接枝鏈出現(xiàn)塌縮，且葡聚糖鏈的塌縮程度更明顯，削弱了鏈傳遞效應(yīng)，降低了蛋白傳質(zhì)速率。ITC結(jié)果

8、表明，對于hIgG，在pH8時(shí)，配基密度和鹽濃度的增加會顯著增加葡聚糖接枝MMI介質(zhì)吸附hIgG的焓變和熵變，說明疏水相互作用增強(qiáng);弱酸條件下，焓變和熵變急劇下降為負(fù)值，說明靜電排斥作用主導(dǎo)了蛋白的解吸;對于BSA，吸附容量隨著鹽濃度的增加而顯著下降，且焓變和熵變值為負(fù)，表明主要通過靜電吸引力吸附BSA。CLSM結(jié)果表明，hIgG和BSA在葡聚糖接枝、聚GMA接枝和非接枝MMI介質(zhì)內(nèi)，均體現(xiàn)出均質(zhì)擴(kuò)散控制的傳質(zhì)機(jī)理;hIgG在高配基密度

9、葡聚糖接枝和中等配基密度聚GMA接枝MMI介質(zhì)內(nèi)體現(xiàn)了更高的熒光強(qiáng)度;相比hIgG，BSA達(dá)到MMI介質(zhì)內(nèi)核所需時(shí)間更短;pH4.0時(shí)，中等配基密度聚GMA接枝MMI介質(zhì)內(nèi)的熒光強(qiáng)度下降最為明顯;以上結(jié)果與宏觀吸附、傳質(zhì)及分離性能相匹配。
　　本文從提高HCIC介質(zhì)的蛋白載量出發(fā)，制備了兩種新型聚合物接枝HCIC介質(zhì)，探討了聚合物接枝、配基密度、接枝密度、pH、添加鹽和蛋白性質(zhì)對聚合物接枝HCIC介質(zhì)吸附和傳質(zhì)性能的影響，并利用I