軟化芽孢桿菌α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中胞外分泌的優(yōu)化.pdf

1、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡稱CGT酶,EC2.4.1.19)能夠通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)轉(zhuǎn)化淀粉及相關(guān)基質(zhì)合成環(huán)糊精。隨著環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣,CGT酶已成為當今研究的熱點。
　　 本實驗室前期的研究工作中,成功實現(xiàn)了Paenibacillus maceransα-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(α-CGT酶)在大腸桿菌中的胞外分泌。為了進一步提高重組α-CGT酶在大腸桿菌中的高效表達,本研究從信號肽的優(yōu)化、細菌素釋放蛋白的

2、共表達和向培養(yǎng)基中添加培養(yǎng)基添加劑促進軟化芽孢桿菌P.maceransα-CGT酶在大腸桿菌.Escherichia coliBL21(DE3)中的胞外分泌。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)通過常規(guī)PCR和重疊PCR獲得了大腸桿菌中常用于外源重組蛋白分泌表達的信號肽基因,將信號肽融合到α-CGT酶成熟蛋白的N端,并在E.coli BL21(DE3)中實現(xiàn)了表達?？疾炝薕mpA、PelB、OmpT和Endoxylanase四個信號

3、肽對重組α-CGT酶在大腸桿菌中胞外分泌的影響。在相同的發(fā)酵條件下,OmpA信號肽介導的重組α-CGT酶分泌效果最好,發(fā)酵72小時,胞外酶活可達32 U/mL,分別是PelB、OmpT介導效率的2.4倍和4.3倍。Endoxylanase信號肽介導的重組α-CGT酶分泌效果相對較差,在胞外只能檢測到很低的α-CGT酶活性,大量α-CGT酶以不可溶性的包涵體形式存在。
　　 (2)采用重疊PCR獲得經(jīng)過改造的BRP蛋白Lpp-BR

4、P的編碼基因,將其克隆到pSTV28載體中,與重組α-CGT酶的表達質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)化E coli BL21(DE3)?？疾炝薆RP蛋白的共表達對目的蛋白胞外分泌的影響。結(jié)果顯示在現(xiàn)有的表達系統(tǒng)中,BRP的共表達對重組α-CGT酶的胞外分泌幾乎沒有促進作用。
　　 (3)考察了不同培養(yǎng)基添加劑如甘氨酸、SDS、Tween-80和Triton X-100等對重組α-CGT酶分泌表達的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘氨酸和Triton X-100對

5、重組α-CGT酶的胞外分泌具有明顯的促進作用。在發(fā)酵15 h時添加0.7％甘氨酸,發(fā)酵48 h時上清液中酶活可達30 U/mL;在發(fā)酵初始時添加0.2％Triton X-100,發(fā)酵48 h時胞外酶活可達28.9U/mL,分別比對照組提高了9.7倍和9.3倍。
　　 (4)在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用兩因素三水平部分因子設(shè)計實驗對甘氨酸和TritonX-100疊加作用的添加濃度進行了優(yōu)化。當培養(yǎng)基中添加0.5％甘氨酸和0.5％Tr

6、itonX-100時,促進作用最明顯;發(fā)酵48 h,胞外酶活可達到48U/mL,是不含任何添加劑對照組生產(chǎn)強度的20倍,比野生菌P.macerans JFB05-01在較優(yōu)條件下的產(chǎn)酶生產(chǎn)強度高95倍。
　　 (5)通過陰離子交換和疏水色譜兩步純化了來自含有添加劑(0.5％甘氨酸和0.5％Triton X-100)和不添加任何添加劑時發(fā)酵上清液中的α-CGT酶,測定兩種來源的α-CGT酶的比活,分別為195.1 U/mg和199