萊鮑迪苷D的生物催化合成及相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)晶條件研究.pdf

1、萊鮑迪苷D（Rebaudioside D，RD）是源自甜葉菊（Stevia Rehaudiana Bertoni）葉片中的四環(huán)二萜類化合物。與其他來自甜葉菊中的主要成分相比較而言，RD不僅保有甜度高（約為蔗糖的200～220倍）、低熱量以及安全無毒的特點(diǎn)，更具有較好的口感、無后苦味，是一種新型甜菊糖類甜味劑。但該類化合物來源稀少，只有甜葉菊Stevia phlebophylla和Stevia rebaudiana兩個(gè)品種能夠生產(chǎn)，且其在

2、甜葉菊中含量甚微，僅占干葉的約0.5％。該化合物在植物體內(nèi)合成的后期是在一系列的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下完成。本研究一方面對RD微生物異源合成方法進(jìn)行了研究，期望能夠定向、高效地合成RD；另一方面擬從結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度去探索RD合成途徑中相關(guān)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的底物識別機(jī)制，基于這些糖基轉(zhuǎn)移酶多步糖基化修飾過程中對結(jié)構(gòu)高度類似的相關(guān)化合物的底物識別機(jī)制，這對于未來開發(fā)各種新型糖基化修飾產(chǎn)物具有重要的科學(xué)意義。
　　本研究以水稻cDNA為

3、模板，擴(kuò)增得到葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因eugt11，構(gòu)建了重組菌株E.coli BL21（pETDuet-eugt11），并成功表達(dá)了重組蛋白6His-EUGT11。將此重組菌E.coli BL21（pETDuet-eugt11）用于在底物二磷酸尿苷葡糖（Uridine diphosphate glucose，UDPG）存在情況下全細(xì)胞催化萊鮑迪苷A（Rebaudioside A， RA）合成RD研究。本研究探討了反應(yīng)體系pH、溫度、檸檬酸鈉

4、濃度、菌體密度、二價(jià)金屬離子、二甲苯體積分?jǐn)?shù)、UDPG添加濃度對反應(yīng)效率的影響。單因素考察結(jié)果顯示，在菌體密度0.16 g濕細(xì)胞/mL反應(yīng)液，底物RA濃度為1.0 mmol/L，pH=8.0，60 mmol/L檸檬酸鈉，1%（v/v）二甲苯，0.1 mmol/L ZnCl2，12.0 mmol/L UDPG，反應(yīng)溫度42℃，反應(yīng)時(shí)間1 d的條件下，RD產(chǎn)量為123.6 mg/L（約0.1 mmol/L）。
　　我們?nèi)缓螅ǖ谒恼鹿ぷ?/p>

5、）涉及對大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行了糖配體UDPG代謝通徑改造，獲得了內(nèi)源性UDPG富集的生產(chǎn)菌株E.coli SG4。以E.coli SG4為宿主表達(dá)pYF09質(zhì)粒上的eugt11基因，獲得高效催化RA生產(chǎn)RD的工程菌E.coli SG4（pETDuet-eugt11）。我們接著探討了反應(yīng)體系pH、時(shí)間、溫度、檸檬酸鈉濃度、菌體量、二價(jià)金屬離子、表面活性劑、蔗糖添加濃度對反應(yīng)效率的影響。單因素考察結(jié)果顯示，在菌體量50 mL培養(yǎng)菌

6、液離心所收集菌，底物RA濃度為1.0 mmol/L，pH=8.0，80 mmol/L檸檬酸鈉，1%（v/v）二甲苯，5 mmol/L ZnCl2，50%（w/v）蔗糖，反應(yīng)溫度42℃，反應(yīng)時(shí)間1 d的條件下，RD產(chǎn)量為1112.21 mg/L（轉(zhuǎn)化率98.5%）。
　　第五章研究RD合成糖基化過程中有五個(gè)關(guān)鍵糖基轉(zhuǎn)移酶（ UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2、UGT91D2以及UGT91D2同源的EUGT11），目前這些

7、糖基轉(zhuǎn)移酶均沒有晶體結(jié)構(gòu)報(bào)道，因此首先需要獲得UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2、UGT91D2和EUGT11蛋白的晶體，并利用X射線（X-ray）衍射的方法來解析它們的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及它們與底物復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)，以便于找出糖基化位點(diǎn)以及它們與底物的結(jié)合區(qū)域。研究工作中將甜葉菊來源的UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2、UGT91D2和UGT91D2同源的EUGT11裝載到大腸桿菌表達(dá)載體中。將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至