N-乙酰鳥氨酸脫酰基酶活性中心的研究.pdf

1、大腸桿菌中由argE基因編碼的N-乙酰鳥氨酸脫酰基酶(N-acetylornithine deacetylase，簡(jiǎn)稱NAOase；EC3.5.1.16)，可選擇性地作用于L-型?；被?，且具有較廣泛的底物特異性，能立體拆分消旋化氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸。此外，對(duì)該酶的研究還具有理論意義和潛在的醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值。迄今為止尚無NAOase三維結(jié)構(gòu)的相關(guān)報(bào)道。
　　 本文首先運(yùn)用生物信息學(xué)軟件分析NAOase的一級(jí)結(jié)構(gòu)，即NAOase主

2、肽鏈由383個(gè)氨基酸組成，理論等電點(diǎn)為5.54，相對(duì)分子質(zhì)量為42kD。由于NAOase與已知金屬酶ACDase，CPG2、DEPE、ACY1、YSCS同源，預(yù)測(cè)分析得NAOase也是一種金屬酶，而且酶活力的表現(xiàn)依賴于鋅離子的存在。
　　 其次預(yù)測(cè)分析NAOase的高級(jí)結(jié)構(gòu)及其活性中心的組成，分析其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。NAOase屬于肽酶M2OA家族ArgE亞家族，12-383肽段是肽酶M20/M25/M40特征區(qū)域。每條亞基由19個(gè)β折

3、疊和13個(gè)α螺旋構(gòu)成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域間以170-180肽段構(gòu)成的柔性鏈接區(qū)相連。酶的活性中心位置由4個(gè)β折疊形成中空，外繞6個(gè)長(zhǎng)度不等的α螺旋，呈環(huán)繞的α/β拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，與M2OA族的ACDase，CPG2，DAPE結(jié)構(gòu)相似。β折疊與鄰近的α螺旋中的氨基酸相互作用，形成一個(gè)細(xì)小狹長(zhǎng)且深的口袋，為底物專一結(jié)合區(qū)。該處主要由Asp82，Asp112，Glu144-145，His355構(gòu)成，即Asp，Glu，His三種氨基酸為酶活性中心的重要

4、氨基酸。其中Glu144，Asp82是催化位點(diǎn)，Glu144為質(zhì)子受體，Hissss，Asp112，Glu145可能是底物結(jié)合位點(diǎn)。
　　 本文通過對(duì)酶活性中心的金屬離子的結(jié)合的研究，驗(yàn)證了NAOase確實(shí)是金屬酶。制備SDS-PAGE電泳純的純酶是研究前提。NAOase是胞內(nèi)酶，對(duì)于100mL10％的菌懸液，200W超聲5s，間歇5s，全程10min是菌的最佳破碎條件。以硫酸銨分級(jí)沉淀進(jìn)行酶液的粗分離，NAOase主要集中在4

5、0％～50％的硫酸銨級(jí)分內(nèi)，然后采用Ni-NTA親和層析進(jìn)一步純化，經(jīng)階段洗脫后可得SDS-PAGE電泳純的酶。純化過程的總回收率為38.3％，純化倍數(shù)為59.9。采用硫酸銨沉淀和一步親和層析分離得到電泳純的NAOase，簡(jiǎn)化了純化步驟。
　　 其次，酶反應(yīng)體系中金屬離子的存在確實(shí)對(duì)酶活力有較大的影響。Co2＋對(duì)酶活力有明顯促進(jìn)作用，最適用量為0.1mmol/L；反應(yīng)體系中外加Zn2＋、Ni2＋、Cu2＋對(duì)酶反應(yīng)有明顯抑制作用，

6、Zn2＋離子濃度越高，抑制作用越強(qiáng)；Mg2＋、Mn2＋、Fe3＋對(duì)酶活的影響不大；低濃度的Mn2＋對(duì)酶活有促進(jìn)作用。
　　 第三，自然酶、Zn2＋脫輔酶及Zn2＋重構(gòu)全酶的活力比較證實(shí)了NAOase為依賴于Zn2＋的金屬酶。Zn2＋在酶分子內(nèi)的作用類似于氨基?；钢?，既維護(hù)酶分子活性部位的特定空間結(jié)構(gòu)又參與酶和底物的反應(yīng)過程，起電子傳遞作用。自然酶、Co2＋脫輔酶及Co2＋重構(gòu)全酶活力的對(duì)比實(shí)驗(yàn)證明了Co2＋不參與活性中心的組成

7、，可能在活性中心外起到傳遞電子和穩(wěn)定酶分子構(gòu)象的作用。
　　 第四，考察酶活性中心重要氨基酸的組成及它們?cè)诨钚灾行牡奈恢么_定。采用苯甲基磺酰氟(PMSF)、N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)、5，5-二巰基-2，2-二硝基苯甲酸(DTNB)、焦碳酸乙二脂(DEPC)、N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3’-sulfonate(WRK)五種化學(xué)試劑，分別選擇性修飾NAOase中Ser的羥基、Trp的吲哚基、Cys的

8、巰基、His的咪唑基、Asp/Glu的羧基，結(jié)果顯示His和Asp/Glu為酶活性中心內(nèi)的重要氨基酸，而Ser、Trp和Cys不參與酶活性中心的形成。其中，His對(duì)底物和酶的結(jié)合起關(guān)鍵作用，Asp/Glu參與形成酶的催化中心。
　　 綜上所述，本文綜合多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)得NAOase為金屬酶，其活性中心Asp，Glu，His三種氨基酸組成，其次采用親和層析分離方法得到SDS-PAGE電泳純的NAOase，考察金屬離子對(duì)NAO