幽門螺桿菌肽脫甲?；富虻目寺　⒈磉_、純化及活性研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)，是胃炎、消化道潰瘍的主要致病因素之一，與胃癌的發(fā)生密切相關，由于人群感染率高、危害大，世界衛(wèi)生組織已將其列為第一類致癌因子。傳統(tǒng)抗菌素治療存在著治愈率低、復發(fā)率高和菌株耐藥性等問題，開發(fā)新型的抗菌藥物成為亟待解決的問題。 尋找特異、準確的靶位是篩選新型抗菌藥物的關鍵。與哺乳動物相比，細菌的蛋白合成具有其特點。細菌蛋白質合成后，其多肽鏈N-端為甲酰化的蛋氨酸，需要首先通過肽

2、脫甲?；?peptidedeformylase，PDF)去除甲基后才能成為成熟蛋白，否則不能完成上述過程，細菌無法生長。因此，PDF成為藥物篩選的新型和潛在的靶位。 本實驗選擇了幽門螺桿菌國際標準株1株、澳大利亞株1株和我國不同地區(qū)(華北、華東、西南、華南)的12個分離株，對其def基因進行了克隆及序列比較，并嘗試了在不同載體中進行表達。根據(jù)GenBank已公布的幽門螺桿菌國際標準株26695、J99的肽脫甲?；富?def

3、ormylase，def)的核苷酸序列，在培養(yǎng)鑒定的基礎上提取細菌DNA，設計特異引物，以PCR方法擴增了def,并克隆到pGEM-Teasy載體中。序列分析表明，所克隆的不同菌株的def基因均為525bp，核苷酸序列的一致性達到了97.50％，氨基酸序列的一致性高達98.13％，與功能相關的基序點未發(fā)生變異。這一結果表明，與其它細菌相同，Hp具有肽脫甲?；富?def)的高度保守性。本工作為表達PDF奠定了基礎，同時，為以PDF為靶

4、位篩選抑制劑提供了理論基礎。 選取和其它株同源性較高的DM株，將def基因克隆入pET-32a(+)表達載體，在宿主細胞BL21(DE3)中進行表達。結果顯示，def基因可以融合蛋白的形式高效表達，但產(chǎn)物大部分以包涵體形式存在，可溶部分含量較低。通過金屬螯和親和層析法純化可溶性融合蛋白，腸激酶酶切后，獲得游離PDF；包涵體變性后，經(jīng)金屬螯和親和層析法純化，透析復性；經(jīng)檢測，可溶性融合蛋白、游離PDF和復性的包涵體蛋白均具有肽脫甲

5、酰基酶活性。 為高效表達可溶性PDF蛋白，以更好地保持酶的活性，將def基因克隆入pET-22b(+)表達載體于BL21(DE3)中誘導表達，發(fā)現(xiàn)表達量低，且多以包涵體的形式存在，結果不甚理想。將def基因克隆入pTrcHisB載體中，分別在宿主細胞TOP10、BL21(DE3)、DH5α、JM109中誘導表達，發(fā)現(xiàn)只有在BL21(DE3)宿主細胞中獲高效表達，且產(chǎn)物以可溶狀態(tài)存在。以金屬螯和親和層析法進行純化后檢測，顯示其具有