腸球菌肽脫甲?；竝df基因的分離與酶活性研究及以PDF為靶點(diǎn)的高通量新藥篩選模型的建立與應(yīng)用.pdf

1、本研究采用生物信息學(xué)方法將已知大腸桿菌、肺炎鏈球菌的PDF氨基酸序列與NCBI Gene bank中部分測(cè)序的腸球菌(Enterococcus faecium)基因組進(jìn)行BLAST比較,獲得腸球菌PDF同源序列.在該同源序列中含有其他微生物PDF酶活性必須的三個(gè)保守基序:Motif1{GXGXAAXQ}、Motif2{EGCLS}和Motif3{HEXDH}.通過(guò)基因序列比對(duì)分析,確定腸球菌中PDF同源序列的開(kāi)放閱讀框(open rea

2、ding frame,ORF),用PCR擴(kuò)增出該開(kāi)放閱讀框并進(jìn)行測(cè)序分析.該擴(kuò)增的腸球菌PDF同源序列與原核蛋白表達(dá)載體pET-30-a(+)連接后,轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá).純化誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,使純度達(dá)到90%以上.腸球菌PDF酶活性分析包括:酶與甲?；牡孜颋or-Met-Val-Ser相互作用的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn),以及溫度、pH對(duì)酶活力的影響.通過(guò)酶活性研究與Western blot分析證實(shí)了所獲得的腸

3、球菌PDF同源序列即為腸球菌的肽脫甲?；富?并將首次分離得到的腸球菌pdf登入NCBI Gene bank(Gene bank Accession number AY238515).以純化的腸球菌PDF為靶點(diǎn),首次建立了體外篩選其拮抗劑的分子高通量篩選模型,并用此模型篩選了近10,000個(gè)樣品,其中化合物樣品為2,000個(gè),微生物發(fā)酵液樣品為8,000個(gè).在近10,000樣品中,獲得10個(gè)抑酶陽(yáng)性樣品,其中微生物發(fā)酵液樣品8個(gè),化合