基于酵母三雜交系統(tǒng)端粒酶抑制劑高通量篩選模型的建立.pdf

1、端粒是真核生物染色體3'末端由富含G的DNA重復(fù)序列和端粒結(jié)合蛋白（telomere binding proteins，TBPS）組成的核蛋白復(fù)合物，就像鞋帶末端的金屬結(jié)一樣，其功能主要是維護(hù)染色體穩(wěn)定，防止染色體發(fā)生丟失、重排、末端融合和被酶消化降解等。正常細(xì)胞復(fù)制時(shí)，由于DNA聚合酶不能完整復(fù)制線(xiàn)型的DNA末端，端粒在每次細(xì)胞分裂后將縮短50-100bp，當(dāng)縮短到一定程度時(shí)，DNA變得不再穩(wěn)定，雙螺旋解開(kāi)，細(xì)胞停止分裂，開(kāi)始衰老或死

2、亡，這就是正常細(xì)胞自身遺傳程序決定的衰老和死亡的原因。而大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞因?yàn)榧せ疃肆Ｃ福╰elomerase），能把端粒縮短的部分補(bǔ)上，細(xì)胞分裂后端粒并不縮短，這是腫瘤細(xì)胞永生化的重要前提條件，也使得端粒酶成為識(shí)別腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的重要標(biāo)志之一。研究表明，90%以上的惡性腫瘤細(xì)胞都激活端粒酶，因此端粒酶成為腫瘤診斷和抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)的新靶點(diǎn)，以端粒酶作為抗腫瘤藥物作用的靶標(biāo)，建立腫瘤抑制劑篩選模型，在分子水平上篩選針對(duì)端粒酶的抑制劑，

3、已成為尋找廣譜抗腫瘤藥物新途徑。人的端粒酶由三個(gè)組分構(gòu)成，端粒酶RNA（Telomerase RNA Component，TR）、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（Telomerase Reverse Transciptase，TERT）和端粒酶相關(guān)蛋白1（Telomerase associated protein，TEP1），端粒酶有活性的最小組成單位hTERT和hTR，重組端粒酶活性需要這兩部分的正確組裝。而hTERT和hTR的結(jié)合，就像酶和底物的結(jié)

4、合，在細(xì)胞周期S期結(jié)合，表現(xiàn)出端粒酶活性，其它期又分開(kāi)，這說(shuō)明hTR-hTERT結(jié)合是可逆的，容易受抑制劑的影響。因此，如果篩選模型是針對(duì)hTR-hTERT的結(jié)合，就能大大提高篩選的特異性。由于hTR是RNA，降解快，體外難以操作，研究RNA-蛋白質(zhì)相互作用的傳統(tǒng)方法在一般的實(shí)驗(yàn)室不易于進(jìn)行，而senGupta等的酵母RNA三雜交系統(tǒng)則巧妙地采取在細(xì)胞內(nèi)合成RNA及研究RNA分子的策略，簡(jiǎn)單易行，而且提供了一個(gè)真核細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境，是用于研

5、究蛋白質(zhì)和RNA相互作用絕佳載體，在酵母三雜交系統(tǒng)中，其它的相互作用都是已知的，唯一可變的是我們需要研究的未知的蛋白質(zhì)和RNA之間的相互作用，只要他們之間存在相互作用，就可用激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，通過(guò)報(bào)告基因的表型特征來(lái)篩選陽(yáng)性克隆。反過(guò)來(lái)，如果研究的RNA與蛋白的結(jié)合是已知的，如hTR-hTERT的結(jié)合，則該系統(tǒng)就可以用來(lái)研究導(dǎo)致hTR-hTERT解離的因素，或者作為篩選抑制hTR-hTERT結(jié)合的藥物篩選模型，即當(dāng)存在抑制兩者結(jié)合的因

6、素時(shí)（與hTR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合hTERT的抑制劑），報(bào)告基因不表達(dá)。并且該系統(tǒng)可以配合高自動(dòng)化點(diǎn)樣技術(shù)，建立高通量的藥物篩選模型。本課題組根據(jù)酵母RNA三雜交原理，首先找到hTR和hTERT之間相互作用的片段，然后利用這些特異的相互作用片段構(gòu)建高通量特異性抑制hTR-hTERT結(jié)合的端粒酶抑制劑藥物篩選模型的酵母，用于特異端粒酶抑制劑的篩選。 目的： 1.分別構(gòu)建能夠表達(dá)不同hTR和hTERT片段的誘餌和獵物質(zhì)粒。 2.

7、利用酵母三雜交原理，將構(gòu)建好的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母，在酵母中研究hTR和hTERT結(jié)合的片段。 3.將存在相互作用的hTR和hTERT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染酵母，利用構(gòu)建好的酵母配合高通量點(diǎn)樣技術(shù)建立高通量酵母三雜交系統(tǒng)（Y3H）。 方法和內(nèi)容： 1.酵母表型檢測(cè)及自激活性檢測(cè)，使用缺陷混合氨基酸[色氨酸（Trp），尿嘧啶（Leu），組氨酸（His）]檢測(cè)酵母菌株YBZ，L40 ura3營(yíng)養(yǎng)需求。 2.不同誘餌載體的構(gòu)建與

8、轉(zhuǎn)化：采用RT-PCR的方法從腫瘤細(xì)胞中擴(kuò)增人端粒酶RNA（hTR）基因后，定點(diǎn)突變?nèi)齻€(gè)位點(diǎn)。分別擴(kuò)增定點(diǎn)突變后的hTR基因假結(jié)合體區(qū)，CR4-CR5及H/ACA，CR7區(qū)hTR基因片段，純化分離定向克隆到pRH3誘餌質(zhì)粒，構(gòu)建包含不同hTR目的基因片段的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)PCR、酶切、測(cè)序鑒定后，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌，進(jìn)行毒性自激活檢驗(yàn)。 3.不同獵物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化：采用PCR法從pCLXSN-hTERT質(zhì)粒

9、中分別釣取含RID1、RID2、RT、C末端等區(qū)hTERT cDNA的片段，純化分離定向克隆到pYESTrp3獵物質(zhì)粒，構(gòu)建包含不同hTERT目的基因片段的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α型大腸桿菌，篩選陽(yáng)性克隆初步鑒定后，擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒雙酶切鑒定后進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌，進(jìn)行毒性自激活檢驗(yàn)。 4.將不同的誘餌和獵物質(zhì)粒按排列組合共轉(zhuǎn)染酵母，用缺陷生長(zhǎng)法對(duì)hTERT和hTR在酵母中的相互作用進(jìn)行確認(rèn)，將初步獲得的

10、存在相互作用誘餌和獵物陽(yáng)性質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化酵母，通過(guò)缺陷生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)，酵母菌落PCR等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。 5.利用自動(dòng)化點(diǎn)樣技術(shù)，將構(gòu)建好的重組酵母三雜交酵母菌L40 ura3（轉(zhuǎn)染了hTERT的RID1和hTR的假結(jié)合區(qū)的L40ura3R1、轉(zhuǎn)染了hTERT的RID2和hTR的CR4-CR5區(qū)的L40ura3R2、轉(zhuǎn)染了hTERT的RID1和RID2和hTR的假結(jié)合區(qū)和CR4-CR5區(qū)的L40ura3R3）用于高

11、通量篩選特異的端粒酶抑制劑，建立Y3H系統(tǒng)。 結(jié)果： 1.結(jié)果顯示：酵母菌株YBZ，L40 ura3基因表型穩(wěn)定，在全培養(yǎng)基（YPD，YC）中生長(zhǎng)良好，但不能在單缺陷性培養(yǎng)基（-Leu，-Trp，-His）中生長(zhǎng)。將YBZ，L40ura3酵母菌株單菌落劃線(xiàn)于含0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mM不同3-AT濃度的SD/-His瓊脂平板上，30℃培養(yǎng)3天后，在YPD培養(yǎng)基上，YBZ不能生長(zhǎng)，L40 ura3酵母

12、菌株有少量菌落生長(zhǎng)。提示YBZ無(wú)His基因滲漏表達(dá)，而用L40 ura3酵母菌株篩選時(shí)需要加3-AT。 2.不同的重組質(zhì)粒pRH3-hTR經(jīng)AatⅡ，AvrⅡ雙酶切鑒定與預(yù)測(cè)結(jié)果相符。測(cè)序結(jié)果證實(shí)，含不同hTR基因片段誘餌重組質(zhì)粒pRH3-hTR構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)化酵母后無(wú)毒性和自激活性。 3.重組質(zhì)粒pYESTrp3-hTERT經(jīng)EcoRⅠ，HindⅢ雙酶切鑒定與預(yù)測(cè)結(jié)果相符。測(cè)序結(jié)果表明pYESTrp3-hTERT獵物融合

13、蛋白表達(dá)載體的基因序列同源性99%以上，讀碼框正確。轉(zhuǎn)化酵母后無(wú)毒性和自激活性。 4.將不同的誘餌和獵物質(zhì)粒按排列組合共轉(zhuǎn)染酵母，和預(yù)測(cè)的結(jié)果一樣，hTERT的RID1區(qū)和RID2區(qū)分別于hTR的假結(jié)合體區(qū)，CR4-CR5存在相互作用。 5.設(shè)立對(duì)照，利用3個(gè)重組酵母菌建立高通量篩選系統(tǒng)可用于特異的端粒酶抑制劑。 結(jié)論： 1.利用RNA三雜交理論，首次將人端粒酶的二個(gè)核心成分hTERT與hTR是否結(jié)合作為