人環(huán)核苷酸磷酸二酯酶4抑制劑高通量篩選系統(tǒng)的建立.pdf

1、人環(huán)核苷酸磷酸二酯酶同工酶選擇性抑制劑有藥用潛力。酶抑制劑可來自合理設(shè)計(jì)或組合庫?，F(xiàn)有高通量篩選方法能夠降低從組合庫發(fā)現(xiàn)酶抑制劑的成本而提高效率，但要求樣品純度大于80％。本實(shí)驗(yàn)室已建立堿性磷酸酶偶聯(lián)孔雀綠定磷法測定環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性方法，及基于競爭結(jié)合、磁分離靶蛋白-配體復(fù)合物高通量篩選配體混合物的方法。本項(xiàng)目建立基于微孔板高通量篩選純化環(huán)核苷酸磷酸二酯酶抑制劑的方法，并考察篩選配體混合庫所需靶蛋白固定化方法。
　　孔雀綠定

2、磷法受高濃度變性蛋白干擾，用微孔板定磷法測定 PDE活性無法離心去除變性蛋白。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)終濃度小于30 mg/L蛋白對孔雀綠定磷無干擾，這就要求基于孔雀綠定磷法高通量篩選PDE抑制劑時靶酶比活性高于0.008 kU/g。全長人環(huán)核苷酸磷酸二酯酶4（hPDE4）和截短突變體（152aa-528aa）編碼序列分別連接到含6His-SUMO原核表達(dá)載體pReceiver-13，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；用Ni-NTA瓊脂糖柱純化。所得全長人PD

3、E4比活大于0.017 kU/g而截短突變體大于0.05 kU/g，可用于微孔板基于孔雀綠定磷高通量篩選純化候選抑制劑庫。用Biotek ELX800酶標(biāo)儀測定了兩種PDE4對cAMP、罌粟堿(PAP)、rolipram的親和性，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與用光度計(jì)常規(guī)測定結(jié)果一致?？梢?，基于微孔板和孔雀綠定磷可高通量篩選純化磷酸二酯酶抑制劑庫。
　　Rolipram是人環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的經(jīng)典抑制劑；文獻(xiàn)報道苯甲酰胺類與其結(jié)構(gòu)相似化合物對豬主動脈

4、 PDE4有很強(qiáng)抑制作用，但未報道對hPDE4是否也有強(qiáng)抑制作用。異香草醛烷基化、氧化以及和氨基化合物酰胺化，合成一系列苯甲酰胺類化合物候選抑制劑，用HPLC確認(rèn)純度都高于80%。用所建立高通量方法測定了該類化合物對全長hPDE4的親和力，發(fā)現(xiàn)該類化合物對全長hPDE4仍有較強(qiáng)抑制活性，但抑制劑的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系明顯不同于用豬主動脈PDE4為靶酶。
　　用酶抑制劑混合物為庫成分篩選抑制劑要求將靶蛋白固定化在磁珠表面且保留活性。Ni2

5、+-NTA磁珠或雙砜磁珠能固定化6His融合表達(dá)靶蛋白。Ni2+-NTA磁珠易制備且固定化反應(yīng)快，但其固定化產(chǎn)物在pH8.0時穩(wěn)定而測定配體親和力適合用pH7.4，且pH值可能影響配體對靶酶親和力。在pH8.0和pH7.4時抑制劑對hPDE4親和力有明顯差異；6His標(biāo)簽融合表達(dá)大腸桿菌堿性磷酸酶與 Ni2+-NTA磁珠結(jié)合后，在pH7.4時3 h內(nèi)固定化酶解離不超過6%，適合從競爭結(jié)合反應(yīng)體系回收90%以上靶蛋白-配體復(fù)合物；6His