Rho激酶和磷酸二酯酶對環(huán)核苷酸依賴性血管舒張作用的調(diào)節(jié).pdf

1、環(huán)核苷酸包括環(huán)-磷酸腺苷(cAMP,或稱環(huán)腺苷酸)和環(huán)-磷酸鳥苷(cGMP,或稱環(huán)鳥苷酸)。作為第二信使物質(zhì),它們在機(jī)體組織細(xì)胞的生物活性中起著重要作用。在血管,其胞內(nèi)濃度的改變直接影響血管平滑肌的反應(yīng)性。cAMP由ATP通過腺苷酸環(huán)化酶的作用而生成。腺苷酸環(huán)化酶既可以通過與之偶聯(lián)的β腎上腺素受體激活(異丙腎上腺素為該受體的激動(dòng)劑),又可以被其激活劑(forskolin)直接激活,從而影響細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平。作為一種強(qiáng)效β腎上腺素受體

2、激動(dòng)劑,異丙腎上腺素(isoprenaline)不僅使血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的cAMP濃度增加,還可以作用于內(nèi)皮細(xì)胞,通過cAMP的作用最終激活eNOS-NO-cGMP信息通路,產(chǎn)生內(nèi)皮依賴性作用,使血管舒張。cGMP要依靠鳥苷酸環(huán)化酶的作用,由GTP生成。在血管,鳥苷酸環(huán)化酶的激活通常需要內(nèi)、外源性NO的作用,也就是說,內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS可以被乙酰膽堿(acetylcholine)或其他內(nèi)皮依賴性舒血管物質(zhì)激活,使NO生成增加:另外,硝普鈉

3、、硝酸甘油等作為NO供體,可以直接釋放NO。NO擴(kuò)散至血管平滑肌細(xì)胞,激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC),進(jìn)而增加cGMP在胞內(nèi)的水平。cAMP和cGMP濃度增加的結(jié)果是降低胞內(nèi)鈣離子的濃度或其敏感性,或者通過其他機(jī)制最終引起血管舒張。同時(shí),二者濃度也受其水解酶磷酸二酯酶(PDE)的影響。研究發(fā)現(xiàn),某些生理病理情況會(huì)導(dǎo)致PDE活性的異常,從而直接改變血管的舒張狀態(tài)。
　　 目前,NO供體被廣泛用于心血管疾病的治療,諸如動(dòng)脈粥樣硬化

4、、高血壓、冠心病等。但是,治療過程中出現(xiàn)的硝酸甘油耐受大大限制了該藥的臨床應(yīng)用。因此,深入了解耐受產(chǎn)生的機(jī)制并探尋合理有效的防治措施,成為亟待研究的課題。在某些病理生理情況下,血栓素(TxA2)的生成增加,該物質(zhì)會(huì)通過TP受體(thromboxane-prostanoidreceptor)激活Rho/Rho激酶通路,引發(fā)鈣敏感化或抑制NO產(chǎn)生,使血管功能發(fā)生異常改變。但是,這種異常改變對cAMP調(diào)節(jié)的血管舒張作用有何影響還未見報(bào)道。

5、r>　　 因此,在本實(shí)驗(yàn)中,我們選取大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈和胸主動(dòng)脈為觀察對象,分別用myograph和organbath的方法對血管張力進(jìn)行測定;用激光共聚焦方法對原代培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)一氧化氮和鈣離子濃度進(jìn)行測定;用ELISA試劑盒檢測血管組織內(nèi)環(huán)核苷酸的水平;并用免疫印跡方法對蛋白水平進(jìn)行檢測,旨在觀察:激活TP受體對cAMP調(diào)節(jié)的內(nèi)皮依賴性和內(nèi)皮非依賴性血管舒張的影響并探討Rho激酶和PDE從中的作用;新型PDE5抑制劑

6、T156對硝酸甘油耐受的影響以及作用機(jī)制是否和增加血管組織內(nèi)cGMP水平有關(guān)。本課題研究對于進(jìn)一步揭示某些病理生理情況下血管功能損傷的機(jī)制和預(yù)防具有重要的意義;并為PDE5抑制劑用于防治硝酸酯類耐受,提高抗缺血藥應(yīng)用的臨床效果提供理論依據(jù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí):1)Isoprenaline引起內(nèi)皮依賴性血管舒張,用L-NAME或ODQ阻斷NO通路后,isoprenaline的內(nèi)皮依賴性舒血管作用消失;U46619(3*10罐M

7、,1*10-7M,3*10-7M)濃度依賴性地抑制isoprenaline引起的血管舒張,并且這一抑制作用被TP受體阻斷劑S18886(0.3μM)完全阻斷;在內(nèi)皮功能完好的血管,Rho激酶抑制劑Y27632和HA1077部分翻轉(zhuǎn)了U46619對isoprenaline引發(fā)血管舒張的抑制作用;但是,在去除內(nèi)皮的血管,兩種藥物卻對U46619的抑制血管舒張作用無明顯影響;當(dāng)把NO通路(L-NAME或者ODQ)阻斷后,U46619對血管舒張

8、的抑制作用不再能被Rho激酶抑制劑(Y27632,HA1077)所翻轉(zhuǎn)。通過原代培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞研究證實(shí),isoprenaline(1*10-7M)可以引起內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生增加和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加,isoprenaline促進(jìn)NO生成的作用被L-NAME阻斷;U46619(1*10-7M)對isoprenaline引起的NO產(chǎn)生和鈣增加均有抑制作用,并且這一抑制作用被TP受體阻斷劑S18886阻斷;給予Y27632和U4661

9、9預(yù)孵20分鐘,然后再給isoprenaline,顯示U46619抑制isoprenaline引起NO生成增加和鈣增加的作用被Y27632不同程度翻轉(zhuǎn)。通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明,U46619(1*10-7M)對isoprenaline(1*10-7M)引起的e-NOS磷酸化有抑制作用,并且這一作用被Y27632部分翻轉(zhuǎn)。
　　 2)在去除內(nèi)皮的血管,isoprenaline和forskolin(兩種增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的藥物)均可

10、引起血管濃度依賴性舒張;U46619(3*10-8M,1*10-7M,3*10-7M)濃度依賴性地抑制上述兩種藥物的舒血管作用,并且這種抑制作用均被TP受體阻斷劑S18886(0.3μM)阻斷;Rho激酶抑制劑Y27632顯著增強(qiáng)了被U46619抑制的舒血管效應(yīng);PDE3和PDE4抑制劑(cilostazol和rolipram),非選擇性PDE抑制劑(IBMX)均部分翻轉(zhuǎn)了U46619對血管舒張的抑制作用;但是,在沒有U46619激活T

11、P受體和Rho激酶的情況下,cilostazol和roliprarn不能影響isoprenaline引發(fā)的血管舒張。cAMP測量結(jié)果顯示,isoprenaline和forskolin均可引起血管組織內(nèi)cAMP水平升高;U46619預(yù)處理抑制了這兩種藥物引起的cAMP濃度增加;并且這種抑制作用被PDE3、PDE4和Rho激酶抑制劑(cilostazol、rolipram和Y27632)所翻轉(zhuǎn)。
　　 3)將內(nèi)皮完好和去除內(nèi)皮的大鼠

12、離體主動(dòng)脈環(huán)在硝酸甘油中預(yù)孵90分鐘,均可以誘導(dǎo)血管產(chǎn)生“硝酸甘油耐受”,即血管對硝酸甘油的舒張反應(yīng)減弱;新型PDE5抑制劑T0156濃度依賴性地抑制了硝酸甘油耐受的形成,使產(chǎn)生耐受的血管舒張反應(yīng)顯著增強(qiáng);在未產(chǎn)生耐受的血管,T0156也能使舒張反應(yīng)增強(qiáng),但改變幅度要明顯弱于產(chǎn)生耐受的血管;cGMP測量結(jié)果也顯示,當(dāng)血管發(fā)生耐受時(shí),與非耐受情況下相比,cGMP濃度顯著降低;T0156作用結(jié)果使cGMP濃度明顯增加,但耐受情況下cGMP濃

13、度增加約為11.6倍,非耐受情況下增加約為6.6倍;在我們的實(shí)驗(yàn)條件下,TxA2受體拮抗劑S18886,內(nèi)皮素受體拮抗劑BQ610以及非選擇性環(huán)氧合酶抑制劑indomethacin對硝酸甘油耐受的形成都沒有影響。
　　 綜上所述,通過本研究課題,可得出以下結(jié)論:
　　 1)TP受體激活可抑制isoprenaline的內(nèi)皮依賴性舒張血管作用,這種抑制作用可能與Rho激酶被激活減少血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子內(nèi)流和磷酸化eNOS的水平