豬中性粒細(xì)胞磷酸二酯酶表達(dá)及活性與中藥抗炎作用的研究.pdf

1、第二信使cAMP、CGMP在各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及細(xì)胞代謝中均發(fā)揮著主導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用。磷酸二酯酶P(DE)是cAMP/PKA和cGMP/PKG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，對調(diào)節(jié)細(xì)胞cAMP、cGMP含量具有決定性作用。中性粒細(xì)胞是最重要的炎癥細(xì)胞，其功能與cAMP水平密切相關(guān)，且胞內(nèi)PDE同功酶中以特異性水解cAMP的PDE4占主導(dǎo)優(yōu)勢，而以中性粒細(xì)胞PDE變化來研究中藥的抗炎作用則未見報(bào)道。因此，以中性粒細(xì)胞PDE為靶點(diǎn)來篩選特異性中藥抑制

2、劑，對中性粒細(xì)胞活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，控制其活化和繼發(fā)的炎癥，則對各種炎癥性疾病的治療具有普遍意義。該項(xiàng)研究不僅能揭示炎癥過程中性粒細(xì)胞功能與PDE表達(dá)及活性的變化規(guī)律，而且能從分子水平豐富中藥的抗炎機(jī)制。研究內(nèi)容如下： 以RT-PCR檢測PDE表達(dá)，以HPIC測定PDE活性。結(jié)果表明：檢測的18個(gè)PDE亞型中，在豬中性粒細(xì)胞表達(dá)的有PDElB、2A、3A、3B、4A、4B、4C、4D、5A、7A、7B、8A、8B、9A、11A共15個(gè)

3、亞型，特異性抑制劑實(shí)驗(yàn)表明PDE4、PDE5分別為水解cAMP、cGMP的兩個(gè)主要存在的型；豬中性粒細(xì)胞內(nèi)存在高活性的PDE，PDE量在一定范圍內(nèi)，與其活性存在良好的線性關(guān)系。因此，以豬中性粒細(xì)胞為樣本提取PDE可作為篩選PDE中藥抑制劑的方法。 實(shí)驗(yàn)選取了祛邪、扶正等共79味中藥。通過PDE活性抑制實(shí)驗(yàn)，篩選出自芍等多昧高效抑制中藥，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)某些中藥如薏苡仁等對PDE活性具有顯著促進(jìn)作用。考察了高效抑制中藥白芍、黃連和金銀花

4、主要有效成分芍藥苷、小檗堿及綠原酸對PDE活性的影響，結(jié)果表明其抑制率均較低。因此，鑒于中藥藥效的整體性及成分的復(fù)雜性，挑選白芍等4昧中藥精制成注射液，PDE抑制實(shí)驗(yàn)表明僅有白芍對其抑制率最高。因此，選出白芍注射液作為‘PDE抑制劑研究其抗炎作用及對。PDE表達(dá)和活性的影響。 以細(xì)胞色素C還原法檢測呼吸爆發(fā)，半定量RT-PCR測定PDE表達(dá)。結(jié)果表明白芍注射液呈劑量依賴性抑制中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)，且對其彈性蛋白酶釋放具有雙重調(diào)節(jié)作

5、用，即低濃度抑制、高濃度促進(jìn)作用。自芍注射液對培養(yǎng)中性粒細(xì)胞PDE活性具有明顯抑制作用，且能在基因轉(zhuǎn)錄水平抑制其主要存在的PDE4B的表達(dá)。以上結(jié)果提示白芍注射液對PDE表達(dá)、活性的抑制和對中性粒細(xì)胞功能的影響存在一定的相關(guān)性，也表明白芍注射液體外具有較好的抗炎作用。 進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)表明白芍注射液對小鼠耳腫脹模型耳腫脹度具有顯著的抑制作用，對小鼠胸膜炎模型血漿MDA含量具有明顯降低作用，顯示了較好的抗炎性。HPIC指紋圖譜分析