以Neprilysin為靶點的藥物篩選模型的建立及應用.pdf

1、盡管現(xiàn)在的醫(yī)療診斷和管理水平都有顯著提高，但全球人民的健康和心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)尤其是高血壓和心力衰竭造成的社會經(jīng)濟負擔，仍然是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。研究發(fā)現(xiàn)在心力衰竭動物模型中，腎臟中的Neprilysin(NEP)蛋白含量增加，活性及表達上調(diào)。NEP(EC3.4.24.11)是中性內(nèi)肽酶，也稱腦啡肽酶，是一種位于細胞膜表面的Ⅱ型含鋅跨膜金屬蛋白酶，主要的生理功能是水解肽鏈氨基端疏水氨基

2、酸殘基。NEP對調(diào)節(jié)血壓的肽類物質(zhì)，如利鈉肽(natriureticpeptide，NP)，緩激肽(Bradykinin，BK)，內(nèi)皮素等具有降解作用，抑制NEP能增加這些血管活性肽的活性，因此NEP成為治療心血管疾病的一個重要靶點。
　　本課題主要目的是通過建立以NEP為靶標的高通量篩選模型，并應用該模型篩選可以作為先導化合物的抑制劑。利用畢赤酵母表達系統(tǒng)，構建重組質(zhì)粒pPICZα-A-NEP，表達載體通過與酵母菌X-33基因組

3、染色體發(fā)生同源重組，將外源基因整合于染色體后實現(xiàn)目的蛋白的表達，表達的蛋白通過Ni2+-NTA親和層析進行分離純化，以此得到純度較高的NEP目的蛋白。應用熒光共振能量轉移法(FRET)檢測蛋白酶活性，優(yōu)化反應條件，建立藥物篩選體系。
　　應用建立的藥物篩選體系篩選了784種化合物和2000種天然產(chǎn)物分段組分，篩選到2種抑制效果較好的化合物，并測定了這2種化合物的IC50值，其中編號為MDCR02的IC50為101.3μmol/L，