以BMP-2為靶點(diǎn)的抗骨質(zhì)疏松藥物篩選模型的優(yōu)化及應(yīng)用.pdf

1、　　本研究室初步建立了一個(gè)以bmp-2啟動(dòng)子為藥物作用靶點(diǎn)、熒光素酶為報(bào)告基因的藥物篩選模型，其通過(guò)測(cè)定模型熒光強(qiáng)度而間接反映藥物上調(diào)活性，屬瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選模型。本論文以此為基礎(chǔ)，從細(xì)胞量、轉(zhuǎn)染方式、轉(zhuǎn)染時(shí)PYJ質(zhì)粒的DNA量與脂質(zhì)體量的比例、轉(zhuǎn)染后至檢測(cè)熒光素酶表達(dá)量的最適時(shí)間等方面優(yōu)化模型的篩選條件?！　榱耸鼓Ｐ透m合高通量篩選，且更為簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、易于操作，我們將模型從瞬時(shí)轉(zhuǎn)染模型改建為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染模型。然后對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染模型的細(xì)胞量

2、、藥物作用時(shí)間等進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)對(duì)比瞬時(shí)轉(zhuǎn)染模型和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染模型，我們發(fā)現(xiàn)后者可完全取代前者，且更經(jīng)濟(jì)、節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本和實(shí)驗(yàn)時(shí)間，熒光素酶表達(dá)測(cè)量值更穩(wěn)定，變異系數(shù)更易控制在10％以下?！　±迷Ｐ秃透倪M(jìn)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染模型，我們篩選了5000個(gè)微生物發(fā)酵液粗提品，500個(gè)合成化合物，對(duì)初篩陽(yáng)性物進(jìn)行五次復(fù)篩，選出高上調(diào)率的2個(gè)陽(yáng)性合成化合物2009481、2009111和1株稀有放線(xiàn)菌5195。通過(guò)半定量RT-PCR驗(yàn)證了2009111可促

3、人MG63細(xì)胞的BMP-2mRNA的表達(dá)。用流式細(xì)胞分析技術(shù)也檢測(cè)到2009481、2009111可在蛋白水平促人MG63細(xì)胞的BMP-2表達(dá)。2009481為蒽酮類(lèi)化合物，2009111為紅景天甙類(lèi)化合物，為抗骨質(zhì)疏松藥物的研發(fā)提供了新方向，其藥理和毒理活性值得進(jìn)一步研究?！　?duì)稀有放線(xiàn)菌5195進(jìn)行擴(kuò)大發(fā)酵、提取分離得到5195的活性組分，并測(cè)得其活性組分濃度在3μg/mL左右能較大幅度提高篩選模型的熒光活性。5195可在蛋白水平