以脂代謝相關(guān)受體為靶點(diǎn)的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物篩選及藥物作用機(jī)制研究.pdf

1、目前，心腦血管疾病是世界發(fā)病率最高的疾病之一，其致死、致殘率高居各類疾病之首。其中，動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的發(fā)生是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。脂質(zhì)代謝紊亂尤其是膽固醇代澍紊亂是目前公認(rèn)的主要致病因子。調(diào)脂藥物的早期研究主要集中于針對低密度脂蛋白受體(lowdensitylipoproteinreceptor.LDLR)通路，他汀類藥物是其代表藥物，具有出色的降膽固醇療效，可明顯降低心臟病及卒中的風(fēng)險(xiǎn)。但是他

2、汀類藥物總的有效率僅為20～40％，因此，心血管疾病遠(yuǎn)未解決，亟需發(fā)現(xiàn)新作用機(jī)制的藥物。近年來，在新型調(diào)脂藥物研發(fā)過程中，血漿脂蛋白代謝過程中的另兩個(gè)關(guān)鍵步驟：膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reversecholesteroltransport，RCT)通路及泡沫細(xì)胞形成(foamcellformation)過程受到越來越多的關(guān)注。本論文圍繞著這兩個(gè)方面開展了相關(guān)藥物篩選和作用機(jī)制研究。 高密度脂蛋白(highdensitylipoprote

3、in，HDL)是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中最主要的膽固醇攜帶者，在這一過程中，B族Ⅰ型清道夫受體SR-BI(人的同源基因命名為CLA-1)發(fā)揮了重要作用。作為HDL的受體，SR-BI參與調(diào)節(jié)肝臟對脂質(zhì)的選擇性攝取，介導(dǎo)HDL膽閻醇酯選擇性進(jìn)入細(xì)胞；另外，在外周細(xì)胞，SR-BI能通過結(jié)合HDL促進(jìn)膽固醇的外流。由于SR-BI在RCT的起始及終末步驟中都發(fā)揮了重要作用，因此被認(rèn)為是抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物的潛在靶點(diǎn)之一。本研究室構(gòu)建了基于細(xì)胞的高密度脂蛋白

4、受體表達(dá)上調(diào)劑高通量篩選模型，對化合物及微生物次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了大規(guī)模篩選，其中陽性菌株04-9179可有效上調(diào)CLA-1啟動(dòng)子的活性，從該菌株發(fā)酵液中分離得到陽性化合物9179A及陽性組分B和C。 本論文第一部分針對CLA-1表達(dá)上調(diào)劑9179A進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，活性檢測及相關(guān)分了作用機(jī)制研究。在前期工作基礎(chǔ)上，經(jīng)化學(xué)及生物學(xué)分析進(jìn)一步確證，9179A為已知化合物TrichostatinA。檢測9179A對人肝癌細(xì)胞HepG2及小

5、鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中CLA-1/SR-BI表達(dá)水平的影響，結(jié)果表明9179A可分別上調(diào)HepG2及RAW264.7中CLA-1/SR-BImRNA及蛋白水平。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測9179A對HepG2和RAW264.7細(xì)胞的脂質(zhì)攝耿能力以及RAW264，7細(xì)胞膽固醇外流能力的影響，結(jié)果表明，9179A可上調(diào)HepG2細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞對DiI-HDL的攝取，還可上調(diào)RAW264.7細(xì)胞的膽固醇外流能力。對9179A分子

6、作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提示，9179A可能通過調(diào)控含有SRE/SP1等順式元件的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)揮上調(diào)CLA-1/SR-BI轉(zhuǎn)錄的作用。此外，我們還對陽性菌株04-9179中陽性組分B和C進(jìn)行了分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和活性測定，結(jié)果表明，化合物9179B和9179C對CLA-1啟動(dòng)子活性的上調(diào)作用較低。 細(xì)胞泡沫化是AS形成的關(guān)鍵步驟。巨噬細(xì)胞上存在的清道夫受體A(SR-A)和B族清道夫受體CD36可導(dǎo)致oxLDL被細(xì)胞無限制攝墩(即在攝

7、取時(shí)不受負(fù)反饋調(diào)控)，因此它們在泡沫細(xì)胞形成中發(fā)揮重要作用。體內(nèi)、外研究顯示，60～90％的巨噬細(xì)胞泡沫化是由CD36介導(dǎo)的。因此CD36被認(rèn)為是抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物的潛在靶點(diǎn)之一。 在本論文第二部分中，我們在火腸桿菌中成功表達(dá)了重組CD36可溶性受體蛋白，并以此為靶點(diǎn)建立了CD36拈抗劑高通量篩選模型。分別擴(kuò)增人CD36全長及可溶性片段(sCD36)cDNA，將它們克隆至pGEM-T載體并測序，分別與大腸桿菌表達(dá)載體pET-30

8、a(+)連接，構(gòu)建CD36及sCD36的重組表達(dá)質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主BL21(DE3)，表達(dá)目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE及WesternBlot檢測獲得成功表達(dá)sCD36的重組菌株E.coliBL21(DE3)/pET-sCD36。該菌株表達(dá)的sCD36蛋白經(jīng)配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)及油紅O染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有配基結(jié)合活性。隨后，利用該重組蛋白建立并優(yōu)化了基于受體.配基競爭性結(jié)合的ELISA-like高通量藥物篩選模型，并應(yīng)用此模