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文檔簡介
1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是缺血性心腦血管疾病(如冠心病、心絞痛、心肌梗塞、腦卒中等)共同的病理生理基礎(chǔ),而外周細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的重要發(fā)病機(jī)制。過量膽固醇從肝外組織中的清除是預(yù)防和治療AS的關(guān)鍵步驟。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1 ABCA1)是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族成員之一,是一種重要的以ATP為能源轉(zhuǎn)運(yùn)各種離子、脂類等細(xì)胞
2、代謝物的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ABCA1可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)磷脂和游離膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至貧脂或無脂的載脂蛋白A-I( apolipoprotein A-I, apoA-I),從而促進(jìn)高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein, HDL)生成。此過程被譽(yù)為脂質(zhì)外流的限速步驟,在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),ApoA- I與ABCA1是類似于一種受體一配體的相互作用來發(fā)揮其功能的。據(jù)此原理,我們建立了基于與ABCA1結(jié)合的ApoA-
3、I的cell-ELISA-like的高通量篩選模型,對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的合成和天然產(chǎn)物化合物庫進(jìn)行大規(guī)模篩選,以其發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)ABCA1活性的化合物,為治療抗動(dòng)脈粥樣硬化的新型先導(dǎo)化合物的出現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。本研究采用trizol法提取MRC-5細(xì)胞總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成。DNA。以此cDNA為模板,采用高保真的Prime Star DNA聚合酶和分段PCR的策略,進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析后,我們從其內(nèi)部選擇了xho I、EcoR I、Nhe I三個(gè)酶切位點(diǎn)
4、,ABCA1 cDNA兩端分別添加了sac I和sal I酶切位點(diǎn),分段克隆了1823bp1061 bp,2750 by和1664by的片段,與pMD-19T simple載體連接并測序正確后,酶切后與真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP載體連接構(gòu)建成功ABCA1( cDNA全長6789bp)的真核表達(dá)載體。將構(gòu)建成功的載體轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞,以6418 SOOg/ml的濃度篩選出穩(wěn)定表達(dá)ABCA1的單克隆細(xì)胞,以此單克隆細(xì)胞包被%孔板,加入
5、8g/ml ApoA- I為配基,孵育2小時(shí)后,依次加入anti-ApoA- I一抗和相應(yīng)二抗,TMB顯色,450nm測定OD值。經(jīng)各項(xiàng)條件優(yōu)化后,建立起以ABCA1為靶標(biāo)的。ell-ELISA-like高通量篩選模型,以ABC家族抑制劑格列本脈為陽性藥對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià),接著對(duì)本室2600個(gè)天然和合成化合物庫進(jìn)行了篩選,從中發(fā)現(xiàn)了一種氧雜蔥酮(口山酮)類化合物No2026791具有明顯的上調(diào)ABCA1活性的作用,其在SOM時(shí)上調(diào)活性達(dá)30
6、%。流式細(xì)胞術(shù)和western-blot分析均證實(shí)了N2026791增加了細(xì)胞表面ApoA- I的結(jié)合,證實(shí)Ns2026791可能為上調(diào)ABCA1介導(dǎo)的脂質(zhì)外流活性的激動(dòng)劑。本研究建立的ABCA1為靶標(biāo)的cell-ELISA-like高通量新藥篩選模型,可用來篩選對(duì)ABCA1脂質(zhì)外流活性起調(diào)節(jié)作用的合成化合物及天然產(chǎn)物提取物,具有一定的創(chuàng)新性和廣泛的實(shí)用性。篩選得到的陽性化合物Ns2026791經(jīng)多種方法證實(shí),具有潛在提高ABCA1脂質(zhì)
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