以PDF為靶點(diǎn)的新藥篩選及活性組分的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定與活性研究.pdf

1、隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用，各種耐藥病原菌大量出現(xiàn)，目前臨床耐藥菌的發(fā)展勢(shì)態(tài)已對(duì)人類健康構(gòu)成極大的威脅。尋找新的作用靶點(diǎn)，研發(fā)新型抗耐藥菌的藥物已成為本世紀(jì)全球關(guān)注的研究熱點(diǎn)之一。肽脫甲?；?peptide deformylase，PDF)是原核生物蛋白成熟過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，而非真核生物所必需。鑒于PDF具有作為藥物篩選靶點(diǎn)的眾多優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛認(rèn)同為最理想的新一代廣譜抗菌藥物篩選分子靶點(diǎn)之一。 本研究采用分子生物學(xué)的方

2、法與技術(shù)對(duì)屎腸球菌(E.faecium)的PDF酶進(jìn)行克隆表達(dá)，用Ni2+金屬螯合親和層析柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離純化，對(duì)純化所得PDF進(jìn)行Western blotting鑒定與活性檢測(cè)。 以純化的PDF為靶點(diǎn)開(kāi)展了抑酶活性物質(zhì)篩選和以E.faecium為檢定菌的抑菌活性物質(zhì)篩選。通過(guò)對(duì)20261個(gè)微生物發(fā)酵樣品的初篩和對(duì)初篩陽(yáng)性樣品的兩次復(fù)篩，獲得6株發(fā)酵產(chǎn)物活性穩(wěn)定的陽(yáng)性菌株，其中游動(dòng)放線菌103A-00723和游動(dòng)放線菌I03

3、A-08772的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)多種G+耐藥細(xì)菌有抑菌活性，包括MRSA、MRSE、E.faecalis HH22(含雙功能修飾酶的糞腸球菌)和VRE。經(jīng)分類鑒定，這兩株菌為游動(dòng)放線菌屬的兩個(gè)新種，分別被命名為Actinoplanes sichuanensis sp.nov．和Actinoplanes Xinjiangensis sp.nov．。鏈霉菌I06A-01113的發(fā)酵產(chǎn)物抗VRE和S．a(chǎn)ureus(金黃色葡萄球菌)的敏感株，但不抗M

4、RSA。 對(duì)獲得的陽(yáng)性菌株I03A-00723進(jìn)行放大發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到95—1、95—1—h1、95—2、95—3、135、205—1、205—2和205—3八個(gè)單一組分，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析95—1、95—2、135、205—1分別被確定為Nb—乙酰色胺、大豆苷元、染料木素和腺苷，95—1—h1、95—3、205—2和205—3因量太少，其結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步鑒定。本研究首次從游動(dòng)放線菌中分離得到Nb—乙酰色胺、大豆苷元和

5、染料木素，并首次發(fā)現(xiàn)這三個(gè)活性物質(zhì)對(duì)PDF酶有抑制作用，而且對(duì)E.faecium有抗菌活性，且大豆苷元和染料木素對(duì)VRE的抗菌活性優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照Actinonin。含量極少的組分95—3對(duì)VRE的抗菌活性優(yōu)于Actinonin和已報(bào)道的陽(yáng)性化合物BB3497和VRC3375，與已進(jìn)入臨床研究的陽(yáng)性化合物L(fēng)BM415的抗菌活性相當(dāng)，是值得深入研究的組分。 本研究還以PDF的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，采用syby17.3軟件中的Surflex—

6、Dock對(duì)我室Microbial Natural Products Database(微生物天然產(chǎn)物庫(kù))進(jìn)行了虛擬篩選，對(duì)部分虛擬篩選陽(yáng)性化合物進(jìn)行了抑酶和抗菌活性檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虛擬篩選獲得的陽(yáng)性化合物Polyoxin B、Spergualin和L-4-oxalysine具有一定的抑酶和抗菌活性。同時(shí)，對(duì)實(shí)物篩選獲得的陽(yáng)性化合物和已知陽(yáng)性抑制劑(Actinonin、LBM415、BB83698、VRC4307、VRC3375和BB34