印楝油體外殺螨活性及其活性物質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定研究.pdf

1、印楝油(neemoil)是印度傳統(tǒng)藥用植物-印楝樹(shù)(AzadirachtaindicaA.Juss)的種子提取物，具有抗寄生蟲(chóng)、抗微生物、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗?jié)兒痛龠M(jìn)傷口愈合等藥理活性。近年來(lái)關(guān)于印楝油抗動(dòng)物體表寄生蟲(chóng)活性的研究主要集中在牛寄生蜱，對(duì)疥螨的生物活性研究較少。為了開(kāi)發(fā)新型植物源殺螨劑和充分利用我國(guó)豐富的印楝資源。本研究探討了印楝油對(duì)兔疥螨(Sarcoptesscabieivar.cuniculi)的體外殺螨活性，

2、在此基礎(chǔ)上，采取生物活性追蹤法對(duì)印楝油進(jìn)行了活性部位的篩選研究和活性物質(zhì)的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定。主要研究結(jié)果如下： 1.印楝油對(duì)兔疥螨幼蟲(chóng)的離體殺螨活性研究：采用平皿法觀察了在相對(duì)濕度(Relativehumidity,R.H)為75％R.H時(shí)，不同溫度和介質(zhì)對(duì)兔疥螨幼蟲(chóng)體外存活率的影響。結(jié)果表明，在相對(duì)濕度為75％R.H，溫度為25℃，介質(zhì)為液體石蠟或花生油的條件下，兔疥螨幼蟲(chóng)體外存活率高，24h存活率在90％以上。該條件可作為

3、離體殺螨試驗(yàn)的環(huán)境條件。 采用浸殺方式觀察了印楝油對(duì)兔疥螨幼蟲(chóng)的離體殺螨活性。結(jié)果表明，未稀釋的印楝油在25.00min內(nèi)殺死所有供試螨蟲(chóng)，殺螨活性顯著強(qiáng)于濃度為500mg/mL，的天然除蟲(chóng)菊酯(825.00min，P＜0.01)，與濃度為25mg/mL的阿維菌素相當(dāng)(18.75min，P＞0.05)；印楝油在24h半數(shù)致死濃度為2.908μL/mL；濃度為500、250和125μL/mL的印楝油對(duì)兔疥螨幼蟲(chóng)半數(shù)致死時(shí)間分別為0

4、.991、2.176和5.33h，其殺螨活性表現(xiàn)出濃度-時(shí)間依賴性。可見(jiàn)印楝油對(duì)兔疥螨幼蟲(chóng)具有顯著的離體殺螨活性。 2.印楝油殺螨活性部位的篩選：采用系統(tǒng)溶劑法對(duì)印楝油進(jìn)行提取分離，并通過(guò)離體殺螨試驗(yàn)篩選活性部位。結(jié)果表明，印楝油石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取部位得率分別為56.82％、25.36％和5.14％。濃度為250μL/mL，時(shí)，三種提取物的殺螨活性在作用前期(12h)和后期(20h)無(wú)顯著差異；在作用中期(16h)，三者

5、的致死率分別為95.15％、80.28％、83.65％，表現(xiàn)為：石油醚提取物殺螨活性顯著強(qiáng)于氯仿和乙酸乙酯提取物(P＜0.05)，而氯仿提取物和乙酸乙酯提取物兩者差異不顯著。可見(jiàn)印楝油石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取部位都具有較強(qiáng)的殺螨活性，其中石油醚提取部位殺螨活性相對(duì)較高，氯仿和乙酸乙酯提取部位殺螨活性相近。 3.印楝油殺螨活性物質(zhì)的跟蹤分離與純化：采用硅膠柱層析法、重結(jié)晶純化技術(shù),結(jié)合離體殺螨試驗(yàn)對(duì)印楝油石油醚和氯仿提取物殺螨活

6、性物質(zhì)進(jìn)行跟蹤分離與純化。結(jié)果表明印楝油石油醚和氯仿提取物均得四個(gè)段位，其中氯仿提取物的段位Ⅲ殺螨活性突出，在濃度為200mg/mL時(shí)，4.5h內(nèi)可殺死所有供試螨蟲(chóng)；對(duì)段位Ⅲ用丙酮反復(fù)重結(jié)晶后得一白色雪花狀結(jié)晶物?？梢?jiàn)印楝油殺螨活性物質(zhì)主要集中在氯仿提取物的段位Ⅲ中，并從中獲得一種結(jié)晶化合物。 4.單體化合物殺螨活性的測(cè)定：采用互補(bǔ)重對(duì)數(shù)模型擬合印楝油單體化合物的離體殺螨毒力。結(jié)果表明，印楝油單體化合物殺螨毒力表現(xiàn)出濃度效應(yīng)是時(shí)

7、間的相關(guān)函數(shù)，時(shí)間效應(yīng)又是濃度的相關(guān)函數(shù)，24h的半數(shù)致死濃度為0.082mg/mL，僅為印楝油的1/33，7.500mg/mL濃度時(shí)的半數(shù)致死時(shí)間為15.33h。可見(jiàn)該單體化合物具有很強(qiáng)的離體殺螨活性。 5.單體化合物的波譜分析：采用紅外波譜、電噴霧電離質(zhì)譜、1H核磁共振、13C核磁共振、無(wú)畸變極化轉(zhuǎn)移增益實(shí)驗(yàn)及二維核磁共振譜等波譜學(xué)分析對(duì)印楝油單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。結(jié)果表明，電噴霧電離質(zhì)譜([M]+，m/z)：636；分子

8、式C40H76O5；紅外(cm-1)：2917.40，2849.33，1471.44，1381.38，717.67(飽和烷基)，1735.84，1182.08，1256.82(-CO-O-)，1139(-O-)；1H核磁共振(CDCl3，400HZ，δ/ppm)：0.86(-CH3)，1.25、1.63、2.35(-CH2-)，4.15為甲氧基上的亞甲基和次甲基氫(-CH2-，-CH-)；13C核磁共振(CDCl3，400HZ，δ/pp

9、m)：173.89為羰基碳，68.45為呋喃環(huán)上次甲基碳，δ65.05為呋喃環(huán)上亞甲基碳，14.09為甲基碳，22.68、24.90、29.13、31.92、34.11均為亞甲基碳；1H-1H二維化學(xué)位移相關(guān)譜：δH0.86與δH1.25偶合相關(guān)，δH1.25與δH1.63偶合相關(guān)，δH1.63與δH2.35偶合相關(guān)：1H異核多量子相干譜：δC14.09與δH0.86相關(guān)，δC22.68，29.13，31.92與δH1.25相關(guān)，δC2

10、4.90與δH1.63相關(guān)，δC34.11與δH2.35相關(guān)，δC65.05，68.45與δH4.15相關(guān)；1H異核多鍵相關(guān)譜：δH0.86與δC22.68、31.92遠(yuǎn)程相關(guān)，δH1.25與δC31.92、24.92遠(yuǎn)程相關(guān)，δH1.63與δC34.11、29.13，δH4.15與δC68.45、65.05遠(yuǎn)程相關(guān)。該化合物被鑒定為十八-碳酸-四氫呋喃-3，4二酯(Octadecanoicacid-tetrahydrofuran-3,