阿維菌素殺螨活性作用靶標及其抗性相關基因鑒定.pdf

1、阿維菌素類藥劑是一種具有良好活性的殺蟲、殺螨和殺線蟲劑，目前被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)害蟲以及衛(wèi)生害蟲的防治，其發(fā)現(xiàn)者日本科學家大村智和愛爾蘭科學家坎貝爾也據(jù)此獲得了2015年諾貝爾生理或醫(yī)學獎。阿維菌素類殺蟲劑的毒理學機制和害蟲對其的抗性機制研究是殺蟲劑毒理學的熱點之一，但在葉螨中的研究目前仍然十分缺乏。目前，阿維菌素對葉螨的毒理學機制研究主要存在以下兩個問題：一是葉螨對阿維菌素的抗性機制主要集中于已知代謝酶及其編碼基因的研究，是否存在其它類

2、型的基因參與葉螨對阿維菌素抗性的形成；二是阿維菌素對葉螨作用的分子靶標以及靶標抗性機制尚不明確。因此，本論文以“朱砂葉螨-阿維菌素類殺螨劑”為研究對象，以解決以上兩個問題為研究目標，進行了朱砂葉螨阿維菌素抗性基因及分子靶標鑒定的系統(tǒng)研究，取得了以下研究成果：
　　1.朱砂葉螨敏感及阿維菌素抗性品系基因芯片檢測
　　在表達譜測序獲得敏感及阿維菌素抗性品系間差異表達基因的基礎上，運用基因芯片技術進一步驗證這些差異表達基因。檢測結

3、果顯示：相對于敏感品系，阿維菌素抗性品系共有52條差異表達基因（21條表達上調(diào)，31條表達下調(diào)）；差異表達基因Gene Ontology（GO）功能注釋發(fā)現(xiàn)其中14條差異表達基因可以注釋到12個GO分類；參考二斑葉螨基因組對差異表達基因進行注釋和分析，發(fā)現(xiàn)抗性品系中上調(diào)表達基因包括兩條谷胱甘肽硫轉移酶(Glutathione S-Transferase，GST)基因，一條細胞色素P450基因和一條酯酶基因；下調(diào)表達基因中包括6條表皮蛋白

4、基因；此外我們也首次發(fā)現(xiàn)大量其它基因可能與阿維菌素抗性相關，如內(nèi)環(huán)裂解雙加氧酶（Intradiol ring-cleavage dioxygenases，ID-ICDs）、絲氨酸蛋白酶（Serine proteases，SPs）、組織蛋白酶L（Cathepsin L）等。
　　2.朱砂葉螨谷氨酸氯離子通道，γ-氨基丁酸氯離子通道基因克隆及其表達模式分析
　　從朱砂葉螨轉錄組中獲得了5條谷氨酸氯離子通道（Glutamate-g

5、ated chloride channel，GluCls）及3條γ-氨基丁酸氯離子通道(Gamma amino butyric acid-gated chloride channel，GABACls)基因序列，設計特異引物克隆獲得了這8條基因cDNA全長（GeneBank登錄號為KT284894-KT284901）。序列比對結果表明，朱砂葉螨8條氯離子通道基因與其它物種的同源基因有著較大的相似性，尤其與其姊妹種二斑葉螨的相似度最高。將朱

6、砂葉螨氯離子通道基因與昆蟲GABA氯離子通道、谷氨酸氯離子通道基因以及二斑葉螨基因組測序獲得的28條半胱氨酸門控離子通道基因進行進化分析，發(fā)現(xiàn)朱砂葉螨GABACls基因和GluCls基因均可以與其對應的其它物種中的同源基因分類到同一分支；此外，朱砂葉螨GABA氯離子通道基因與二斑葉螨及其它昆蟲的RDL基因（GABACl亞基）親緣性最近，說明3條GABA氯離子通道基因均屬于RDL同源基因，但在朱砂葉螨中未發(fā)現(xiàn)有GRD和LCCH同源基因（G

7、ABACl亞基）。采用定量PCR技術解析8條氯離子通道基因在朱砂葉螨不同發(fā)育階段的表達模式，結果顯示所有基因在卵期的表達量相對最低，在其它螨態(tài)之間也略有差異。
　　3.朱砂葉螨氯離子通道基因在爪蟾卵母細胞中的表達
　　使用爪蟾卵母細胞表達系統(tǒng)成功表達了5條GluCls和3條GABACls基因。在特異性神經(jīng)遞質(zhì)（谷氨酸或GABA）的刺激下，卵母細胞出現(xiàn)內(nèi)向電流，據(jù)此明確了基因編碼通道蛋白的生理功能。通道蛋白的檢測電流與谷氨酸或

8、是GABA灌流呈現(xiàn)出一定的濃度效應，并據(jù)此計算5條谷氨酸氯離子通道蛋白的EC50值為TcGluCl2（3.019±0.0354 M）>TcGluCl3（2.983±0.0181 M）>TcGluCl1（2.884±0.0472 M）>TcGluCl4（2.851±0.0340 M）>TcGluCl5（2.701±0.0380 M）；3條GABA氯離子通道蛋白的EC50值為TcRDL3（1.086±0.032 M）>TcRDL2（0.67

9、7±0.042 M）>TcRDL1（0.445±0.047 M）。
　　4.阿維菌素殺螨作用分子靶標的鑒定
　　通過RNAi技術沉默朱砂葉螨5條GluCls基因后，朱砂葉螨對阿維菌素的敏感性下降；同樣地，沉默3條GABACls基因后，朱砂葉螨對阿維菌素的敏感性也下降。而電生理學研究表明5條GluCls對阿維菌素和伊維菌素均敏感，并且對阿維菌素的電流反應要大于伊維菌素；3條GABACls對阿維菌素和伊維菌素均不敏感。綜合電生理