蜜蜂螺原體幾丁質(zhì)酶、幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因的研究及螺原體對意蜂抗氧化相關(guān)酶的影響.pdf

1、螺原體(spiroplasma)是柔膜菌綱中一種螺旋狀無細胞壁的原核微生物，能與節(jié)肢動物和植物相互作用。在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上，螺原體與芽孢桿菌綱及其他營自由生活的厚壁菌門的細菌親緣關(guān)系較近。我國蜜蜂螺原體病發(fā)生非常普遍，Spiroplasmamelliferum是蜜蜂“爬蜂病”主要病原之一，基本生物學(xué)特性已被詳細研究，但對其致病機制了解很少。通過比較基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蜜蜂螺原體S.melliferum存在2種特有的基因——幾丁質(zhì)酶

2、和幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因，而其他幾種借助昆蟲傳播但對昆蟲無致病性的螺原體（如S.cirri和S.kunkelli）沒有發(fā)現(xiàn)這2種基因，推測這2個基因與致病性直接相關(guān)，在螺原體入侵蜜蜂過程中起作用。本論文克隆表達了蜜蜂螺原體幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因并測定了幾丁質(zhì)脫乙酰酶活力和酶學(xué)性質(zhì)。另一方面，蜜蜂在受到螺原體侵染后會產(chǎn)生一系列抗氧化相關(guān)的防御反應(yīng)，本文分析了感染螺原體后蜜蜂抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)中相關(guān)酶活變化。主要研究結(jié)果有:
　　第一、

3、應(yīng)用生物信息學(xué)方法和在線預(yù)測工具，對蜜蜂螺原體CH-1幾丁質(zhì)脫乙酰酶的理化性質(zhì)、功能域等進行預(yù)測分析，揭示蜜蜂螺原體幾丁質(zhì)脫乙酰酶與其他細菌該酶的進化關(guān)系。結(jié)果顯示:(1)S.melliferum CH-1中的幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因相對分子質(zhì)量為26 kD;(2)酸堿性氨基酸比例較其他細菌小，主要表現(xiàn)為親水性，無明顯的跨膜區(qū)和信號肽，整個肽鏈位于細胞膜外，可能是外分泌蛋白;(3)與其他細菌幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因序列比對顯示該目的蛋白含有3個保守

4、的基序(motif)，可能是重要的功能域。對該蛋白進行生物信息學(xué)分析能夠預(yù)先了解目的蛋白的基本性質(zhì)和假設(shè)的空間結(jié)構(gòu)，這對后續(xù)表達目的蛋白和功能探索起前導(dǎo)作用，并與后續(xù)的研究結(jié)果相互驗證。
　　第二、由于密碼子TGA在多數(shù)柔膜菌綱細菌中編碼色氨酸而非終止密碼子，因此柔膜菌相關(guān)基因在大腸桿菌中的表達受到限制。為研究蜜蜂螺原體CH-1幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)脫乙酰酶的致病性，本文利用重疊延伸PCR定點突變技術(shù)克隆蜜蜂螺原體CH-1中可能與致病相

5、關(guān)的幾丁質(zhì)酶(chitinase)基因chiA以及幾丁質(zhì)脫乙酰酶(chitindeacetylase，CDA)基因chid,利用表達載體pET-28a(+)進行蛋白表達，NTA-Ni2+柱純化，Western blot驗證，測定其活力和酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果顯示:(1)成功克隆到chiA、chid基因全長，并得到有活性的外源表達的完整幾丁質(zhì)脫乙酰酶蛋白和以包涵體形式表達的幾丁質(zhì)酶蛋白。幾丁質(zhì)酶及幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因編碼區(qū)分別為768bp、672b

6、p，分別編碼255、223個氨基酸組成的約32 kD、28 kD的蛋白質(zhì);(2)研究中采用兩種方法對幾丁質(zhì)酶包涵體蛋白進行復(fù)性，由于瞬間表達的蛋白質(zhì)量太多以至于未能進行正確的折疊而未能成功獲得有活性的目的蛋白，后續(xù)研究中可以嘗試選擇以畢赤酵母為載體的真核表達系統(tǒng)進行外源表達。
　　第三、利用紫外分光光度法測定了外源表達幾丁質(zhì)脫乙酰酶的酶活力和部分酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果顯示:(1)測得外源表達的該酶活力最高可達10.14 U·mL-1;(2

7、)最適溫度為50℃左右，最適pH值為7.0-7.5，該酶對溫度較不敏感，各個溫度梯度對該酶處理30 min后，在35℃-60℃之間仍能保持60％以上活力，pH值穩(wěn)定性試驗研究表明該酶是一種較耐堿性的酶;(3)一價金屬離子Na+和K+均對CDA酶活性表現(xiàn)出促進趨勢;二價金屬離子對CDA酶活力影響表現(xiàn)出三種趨勢，分別是Ca2+、Mg2+主要表現(xiàn)為抑制作用，Zn2+對CDA酶活力無明顯影響，F(xiàn)e2+能促進酶活性。三價金屬離子Fe3+和Al3+

8、離子能夠在很低的離子濃度影響CDA酶活性，主要表現(xiàn)為促進作用。
　　第四、通過飼喂對數(shù)期螺原體菌液感染意蜂，研究了接種后不同時間段蜜蜂體內(nèi)抗氧化相關(guān)酶活性變化。結(jié)果表明:(1)在蜜蜂螺原體致病菌S.melliferum CH-1感染后，第3天蜜蜂表現(xiàn)出“爬蜂病”癥狀，第5天死亡率達到最大值。(2)感染第3天時，抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)中過氧化氫酶(catalase/CAT)活力先下降，隨著感染時間的延長，在第5、7天表現(xiàn)為上升趨勢，但與未感