阪崎腸桿菌脫乙酰酶的酶學(xué)性質(zhì)分析和定向改良研究.pdf

1、D-氨基葡萄糖(GlcN)在人體中主要提供保護(hù)和潤(rùn)滑作用，由于它的多種生物活性而廣泛應(yīng)用在食品保健品和生物類(lèi)藥品中。本研究通過(guò)尋找高活性的N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶(nagA)，構(gòu)建工程菌，建立酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)氨基葡萄糖工藝，旨在降低成本，提高生產(chǎn)效率。
　　本研究從阪崎腸桿菌Cronobacter sakazakii中克隆到一個(gè)CsnagA，該基因由1149bp組成，編碼382個(gè)氨基酸，該蛋白酶分子大小為41.3kDa。在

2、相關(guān)NAGPase序列報(bào)道中，與來(lái)源于E.coli K-12的EcNAGPase序列相似性最高(87％)。本文通過(guò)構(gòu)建工程菌pGEX-6p-CsnagA/E.coli BL21(DE3)，與來(lái)源于E.coli K-12的工程菌pGEX-6p-EcnagA/E.coli BL21(DE3)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，二者的最適反應(yīng)溫度和最適pH分別均為50℃和8.0。在40℃，50℃，60℃處理1h，CsNAGPase和EcNAGPase活性均保持

3、90％以上，經(jīng)過(guò)不同pH緩沖液處理后，CsNAGPase和EcNAGPase在pH5.0-9.0范圍內(nèi)均有超過(guò)80％的活性。Co2+對(duì)CsNAGPase的活性有很大的激活作用，而EDTA抑制CsNAGPase的活性。酶動(dòng)力學(xué)分析表明:CsNAGPase的催化效率（kcat/Km）比EcNAGPase的高72.12％。而且CsNAGPase具有比EcNAGPase更好的轉(zhuǎn)化率，在反應(yīng)5h之后，CsNAGPase在底物濃度為4mM時(shí)有最大轉(zhuǎn)

4、化率為78.85％，而EcNAGPase在底物濃度為5mM時(shí)達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率(58.45％)，CsNAGPase的轉(zhuǎn)化率比EcNAGPase高34.90％;在CsNAGPase酶促反應(yīng)體系中加入終濃度為5mM Co2+時(shí)，CsNAGPase在底物濃度為1mM時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到93.56％，比不加Co2+的轉(zhuǎn)化率提高了18.66％。
　　為了改良CsNAGPase的酶學(xué)性質(zhì)，利用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)突變體進(jìn)行高通量篩選，從9000多個(gè)突變體中篩選