食品中阪崎腸桿菌(克羅諾桿菌屬)快速檢測體系的建立與應(yīng)用.pdf

1、阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）是一種重要的食源性條件致病菌，可以引起新生兒嚴(yán)重的腦膜炎，壞死性小腸結(jié)腸炎和菌血癥等疾病，在新生兒中有較高的致死率。該菌已從多種食品和環(huán)境樣品中檢出。建立快速、特異、靈敏的阪崎腸桿菌檢測方法對于食品安全監(jiān)控具有重要意義。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測方法，因其靈敏度高、特異性強、檢測速度快等優(yōu)勢，在食源性致病菌的快速檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 本研究建立了食品中阪崎腸桿菌新的PCR檢測體系，研究內(nèi)容主要

2、包括以下幾個方面:
　　 1.阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）常規(guī)雙重PCR檢測方法的建立
　　 針對阪崎腸桿菌遺傳的多樣性、分類的復(fù)雜性，以及單重PCR檢測方法易于產(chǎn)生假陽性的問題。本試驗以阪崎腸桿菌基因組16S rRNA基因以及局部大分子合成(macromolecular synthesis，MMS)操縱子的特異序列為靶序列，設(shè)計兩對引物，經(jīng)反應(yīng)體系和條件優(yōu)化，建立了常規(guī)雙重PCR檢測方法，并對檢測方法進(jìn)行了評價。特異性檢

3、測結(jié)果顯示，阪崎腸桿菌菌株P(guān)CR擴(kuò)增均可見2條特異性條帶，而其他菌株P(guān)CR擴(kuò)增均為陰性，純菌檢測雙重PCR的靈敏度為6.3×103 CFU/mL，而相對應(yīng)16S rRNA和MMS操縱子序列單重PCR的靈敏度分別為6.3×101 CFU/mL和6.3×103 CFU/mL。人工污染的食品樣品（奶粉、牛奶、雞肉）在經(jīng)過24 h增菌后，檢測限均可達(dá)100 CFU/mL（或CFU/g）。在鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimuri

4、um）存在的條件下，雙重PCR檢測方法的檢測限沒有受到影響。本試驗建立的常規(guī)雙重PCR檢測方法具有很好的特異性和靈敏度，能克服食品樣品基質(zhì)及雜菌的干擾，可應(yīng)用于食品中阪崎腸桿菌的檢測。
　　 2.含有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的阪崎腸桿菌Taqman熒光定量PCR檢測方法的建立
　　 在pTG-19載體上選取一段與靶序列同源性較低的序列，采用復(fù)合引物法構(gòu)建競爭性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，并設(shè)計相應(yīng)探針。以大分子合成(MMS)操縱子序列為靶序列，優(yōu)化并建立

5、了含有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的阪崎腸桿菌real-time PCR檢測方法。對67株菌株（4株阪崎腸桿菌）進(jìn)行了檢測，結(jié)果所有阪崎腸桿菌檢測都為陽性，其他菌株都為陰性，且擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)都可見擴(kuò)增信號。純培養(yǎng)物和奶粉中該檢測方法的檢測限均為1.2×103CFU/mL（1.2×101 CFU/反應(yīng)），人工污染的食品樣品在經(jīng)過24 h增菌后可以檢測低至100 CFU/mL(g)的阪崎腸桿菌。在108 CFU/mL鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimu

6、rium）存在的情況下real-time PCR檢測方法的檢測限并沒有受到影響。因此本研究中具有高特異性和靈敏性的real-time PCR檢測方法可用于食品中阪崎腸桿菌的快速檢測，并且擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的加入可有效降低假陰性結(jié)果出現(xiàn)的可能。
　　 3.快速檢測方法在食品檢測中的應(yīng)用
　　 為了評價快速檢測方法的準(zhǔn)確度，并了解阪崎腸桿菌在食品中的分布情況，本研究對6種（92份）食品樣品進(jìn)行了阪崎腸桿菌檢測。分別使用傳統(tǒng)生化培養(yǎng)鑒定