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1、目的:研究過表達(dá)α-synuclein野生型和突變型(A53T、A30P)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,AST)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基系統(tǒng)及細(xì)胞凋亡的影響。
方法:分離培養(yǎng)和純化新生1-3天SD大鼠皮質(zhì)區(qū)的AST,用免疫熒光的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定(GFAP),Western blot檢測(cè)AST內(nèi)源性α-synuclein的表達(dá)。用293FT細(xì)胞對(duì)前期已經(jīng)構(gòu)建好的(WT、A30P、A53T)α-synuclein-HA-FUIG W-
2、GFP、GFP-fuigw質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝,收獲病毒上清后分別感染AST,分為過表達(dá)野生型組(WT組)、A30P組、A53T組和對(duì)照組(FUIGW組)。5-7天后免疫熒光及Western blot檢測(cè)AST中(WT、A30P、A53T)α-synuclein-HA融合蛋白的表達(dá)。衣霉素處理AST6小時(shí)作為陽性對(duì)照組,Western blot檢測(cè)各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)蛋白BIP、CHOP的變化;免疫熒光檢測(cè)各組GM130觀察高爾基體形態(tài)的變
3、化;流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率的變化。
結(jié)果:1)星形膠質(zhì)細(xì)胞有內(nèi)源性α-synuclein的表達(dá)。
2)慢病毒感染AST5-7天后免疫熒光及Western blot可檢測(cè)到過表達(dá)野生型組(WT組)、A30P組、A53T組α-synuclein-HA融合蛋白的表達(dá),而FUIGW組未檢測(cè)到α-synuclein-HA融合蛋白的表達(dá)。
3)過表達(dá)野生型組(WT組)、A30P組、A53T組BIP、CHOP指標(biāo)明
4、顯高于對(duì)照組(FUIGW組)(P<0.05);過表達(dá)野生型組(WT組)與A30P組、A53T組相比BIP、CHOP表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)。
4)過表達(dá)野生型組(WT組)與A30P組、A53T組的高爾基體分散在細(xì)胞質(zhì)中,囊泡碎裂;對(duì)照組(FUIGW組)高爾基體分布在細(xì)胞核一側(cè),囊泡完整無碎裂。經(jīng)x2檢驗(yàn),過表達(dá)野生型組(WT組)、A30P組、A53T組的高爾基體碎裂百分比明顯高于對(duì)照組(FUIGW組)(P<0.01);
5、過表達(dá)野生型組(WT組)與A30P組、A53T組的高爾基體碎百分比差異無顯著性(P>0.05)。
5)過表達(dá)野生型組(WT組)、A30P組、A53T組的AST凋亡率明顯高于對(duì)照組(FUIGW組)(P<0.01);過表達(dá)野生型組(WT組)與A30P組、A53T組的AST凋亡率差異無顯著性(P>0.05)。
結(jié)論:
過表達(dá)α-synuclein野生型和突變型(A53T、A30P)可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體系統(tǒng)損傷
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