CaMKⅡ在鎘致原代大鼠成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑中的作用.pdf

1、鎘作為廣泛存在的重金屬污染物，通常以鎘離子的形式通過鈣離子泵、離子通道型受體等進入細胞，進而影響胞內(nèi)鈣離子分布。胞內(nèi)鈣離子濃度改變引起CaMKⅡ表達水平的變化以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。而CaMKⅡ在成骨細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中的作用鮮有報道。為了研究鎘致鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激產(chǎn)生的影響，原代成骨細胞暴露于鎘及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子通道抑制劑2-APB，流式細胞術測定細胞內(nèi)鈣離子濃度，RTCA檢測細胞存活率，蛋白免疫印跡法檢測UPR相關蛋白的表達。結果表

2、明2μmol/L醋酸鎘、50μmol/L2-APB及其共處理成骨細胞后，與對照組相比，鎘處理導致細胞存活率顯著降低，且伴隨著細胞內(nèi)鈣離子濃度升高（P＜0.01）;2-APB與鎘共處理組和鎘處理組相比，細胞內(nèi)鈣離子濃度顯著降低（P＜0.01）;不同濃度的醋酸鎘（0、0.25、0.5、1、2、5、10μmol/L）處理6h或2μmol/L醋酸鎘處理成骨細胞不同時間（0、0.5、1、5、10、30 min或2、4、6h）后，與對照組相比，2μ

3、mol/L醋酸鎘處理成骨細胞6小時能顯著提高BiP、ATF4、CHOP三個蛋白的表達水平（P＜0.05或P＜0.01）。為了研究鎘對成骨細胞CaMKⅡ表達的影響及CaMKⅡ在鎘致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中的作用，原代成骨細胞暴露于鎘、2-APB或CaMKⅡ抑制劑KN93，RTCA檢測細胞存活率，蛋白免疫印跡法檢測CaMKⅡ、P-CaMKⅡ和UPR相關蛋白的表達。結果表明與對照組相比，2μmol/L醋酸鎘處理成骨細胞6小時能顯著提高CaMKⅡ的磷酸化水

4、平;與鎘處理組相比，2-APB與鎘共處理組顯著降低CaMKⅡ的磷酸化水平;而KN93與鎘共處理組顯著提高細胞存活率，且顯著降低了ATF4和CHOP蛋白的表達(P＜0.05或P＜0.01)。為了研究鎘致成骨細胞凋亡的過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和CaMKⅡ的作用，成骨細胞暴露于鎘、2-APB或KN93，流式細胞術檢測細胞凋亡率，雙苯酰亞胺(Hoechst33258)染色觀察細胞核形態(tài)，蛋白免疫印跡法檢測Caspase-12、3，Bax和Bcl-2蛋白

5、的表達。結果表明2μmol/L鎘暴露成骨細胞6h后，細胞凋亡率、Caspase-12、3蛋白活化水平和Bax/Bcl-2水平極顯著高于對照組（P＜0.01）;2-APB與鎘共處理組以及KN93與鎘共處理組細胞凋亡率、Caspase-12、3蛋白活化水平和Bax/Bcl-2水平極顯著低于鎘處理組(P＜0.01); Hoechst33258染色結果與上述一致。綜上所述，鎘通過引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子造成胞漿鈣超載，誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，最后通過C