從Wnt途徑探討高壓氧促離體神經(jīng)干細(xì)胞分化機(jī)制.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是足月新生兒腦損傷的最常見原因，可引起新生兒急性死亡和慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷，從而引起腦癱、癲癇、智力低下等嚴(yán)重后遺癥，給家庭社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。盡管近年來圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)取得了很大的進(jìn)展，但HIE仍缺乏有效的治療，其傷殘率及病死率仍高達(dá)30％。因此，尋求有效的治療方法足一件迫在眉睫的大事。
　　 高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)

2、治療是目前認(rèn)為可能有效的治療方法之一。我們的課題組在以前的整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)新生大鼠的SVZ和DG部位的神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)明顯減少，HBO治療可促使SVZ和DG的NSCs增殖(余小河，2006)。課題組進(jìn)一步證實(shí)，HBO治療可以促進(jìn)HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖，且這種增殖的NSCs可遷移到腦損傷的部位

3、并分化為成熟的神經(jīng)元；其機(jī)制與Wnt信號(hào)途徑中Wnt-3蛋白表達(dá)的增加及β-catenin蛋白的活化有關(guān)(王曉莉，2007)。這些研究結(jié)果為HBO治療HIBD的臨床應(yīng)用提供了有利的理論依據(jù)。但我們以前的研究主要足在整體動(dòng)物水平進(jìn)行的，細(xì)胞水平的研究將更有利于作用和機(jī)制的探討，在這以前我們尚未開展細(xì)胞水平的研究。
　　 腦損傷發(fā)生后，機(jī)體會(huì)啟動(dòng)內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制，減輕損傷程度。當(dāng)損傷發(fā)生時(shí)存在于腦內(nèi)內(nèi)源性NSCs可被激活，對(duì)損傷的腦組

4、織起到修復(fù)作用。我們課題組既往的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了HIBD新生大鼠的腦組織勻漿可促進(jìn)BMSCs分化成為神經(jīng)元樣細(xì)胞(謝岷，2007)。因此我們推測，在HIBD后的腦組織會(huì)產(chǎn)生某些內(nèi)源性的抗損傷因子改變了微環(huán)境，喚醒那些蟄伏的內(nèi)源性NSCs，促使其分化為神經(jīng)細(xì)胞。那么經(jīng)HBO處理后的新生大鼠腦組織是否也會(huì)通過產(chǎn)生某些內(nèi)源性的抗損傷因子、改變腦組織的微環(huán)境而起到治療作用呢?如果能夠證明這一點(diǎn)，這將為HBO治療的機(jī)制提供了新線索。
　　

5、NSCs的體外培養(yǎng)花費(fèi)昂貴，且懸浮培養(yǎng)的NSCs易貼壁分化，給研究帶來一定的困難。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是骨髓中的一群未定向分化的干細(xì)胞，來源廣泛，取材方便、簡單，在特定分化條件下能分化成神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元，故越來越廣泛的應(yīng)用于神經(jīng)方面的研究。在大量的整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，將BMSCs移植入損傷的大腦，BMSCs可分化為神經(jīng)細(xì)胞，但由于其分化為神經(jīng)細(xì)胞的比例低，限制了其臨床應(yīng)用

6、。如何擴(kuò)大其分化為神經(jīng)細(xì)胞的比例呢?根據(jù)我們以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測HBO有可能起到促使BMSCs向神經(jīng)元分化的作用。但結(jié)果究竟如何，迄今國內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)，胚胎期NSCs的發(fā)育與BMP、Wnt等信號(hào)系統(tǒng)有密切聯(lián)系。我們?cè)谡w動(dòng)物上已發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與HBO誘導(dǎo)內(nèi)源性NSCs增殖和分化成為神經(jīng)細(xì)胞密切相關(guān)。骨形成蛋白(bonemorphogenetic protein，BMP)不僅參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程，

7、而且在決定NSCs分化方向中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。這兩條信號(hào)通路是否在HBO治療后的NSCs分化進(jìn)程中起作用，尚未見報(bào)道。
　　 因此，本課題擬在細(xì)胞水平研究HBO誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞；HBO誘導(dǎo)NSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞；HBO對(duì)腦組織微環(huán)境的影響；HBO治療的分子機(jī)制等內(nèi)容，為同種自體干細(xì)胞移植治療腦損傷提供理論依據(jù)。
　　 本課題研究分為以下三部分：
　　 一、高壓氧對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的影

8、響
　　 目的：HBO對(duì)離體BMSCs分化的影響及相關(guān)機(jī)制的初步研究。
　　 方法：取傳至第3-5代BMSCs，加入含10ng/mlbFGF、20ng/mlEGF和2％B27的DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基誘導(dǎo)24小時(shí)。將誘導(dǎo)后的BMSCs分為對(duì)照組(CON，不作HBO處理)和HBO處理組(HBO，壓力為2ATA，穩(wěn)壓60min，處理1次)。HBO后繼續(xù)培養(yǎng)24h，2組細(xì)胞在同一時(shí)間行免疫熒光染色，分別進(jìn)行NSE、GF

9、AP、O4染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)BMSCs分化為NSE陽性細(xì)胞、GFAP陽性細(xì)胞和O4陽性細(xì)胞的百分率。同時(shí)用Western-blot檢測2組細(xì)胞Wnt3蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：BMSCs用神經(jīng)干細(xì)胞的經(jīng)典培養(yǎng)基誘導(dǎo)后Nestin表達(dá)明顯增加。免疫熒光發(fā)現(xiàn)，HBO組的NSE陽性細(xì)胞和O4陽性細(xì)胞的分化率與CON組比較明顯增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；但GFAP陽性細(xì)胞的分化率2組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；We

10、stern-blot檢測Wnt3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HBO組Win3的表達(dá)明顯比CON組增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。
　　 結(jié)論：HBO可以促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，其機(jī)制可能與Wnt3蛋白的活化有關(guān)。
　　 二、高壓氧和腦組織勻漿對(duì)NSCs分化的影響
　　 目的：本研究旨在探討HBO和腦組織微環(huán)境改變對(duì)離體NSCs分化的影響。
　　 方法：取出生3日內(nèi)新生Sprague-Dawley

11、大鼠的腦皮質(zhì)組織，在含B27，bFGF和EGF的DMEM/F12培養(yǎng)肇中懸浮培養(yǎng)NSCs，傳代后行Nestin，NSE，GFAP免疫熒光染色，進(jìn)行鑒定。第一步，找出HBO作用的最佳壓力和時(shí)間。將傳至2-3代的NSCs分為7組：對(duì)照組(CON，不作HBO處理)；HBO組根據(jù)不同的壓力(1ATA，2ATA，3ATA)和時(shí)間(30 min，60 min)分為6組(n=6)，即1 ATA-30min，2ATA-30min，3ATA-30min，

12、1ATA-60min，2ATA-60min，3ATA-60min。第二步，采用上述實(shí)驗(yàn)獲得的最佳作用的壓力和時(shí)間(2 ATA，60min)，觀察HBO和微環(huán)境改變對(duì)NSCs分化的影響，研究分為5組(n=6)：①對(duì)照組(CON)，不作HBO及腦組織勻漿處理；②高壓氧處理組(HBO)，NSCs給予HBO(2 ATA，60 min)處理；③正常腦組織勻漿組(NBH)，NSCs與正常腦組織勻漿上清液共培養(yǎng)；④缺氧缺血性損傷腦組織勻漿組(HIBH

13、)，NSCs與HIBD上清液共培養(yǎng)；⑤HIBH+HBO組：NSCs與HIBD上清液共培養(yǎng)1h后行HBO(2 ATA，60 min)處理。HBO后繼續(xù)培養(yǎng)24h，各組細(xì)胞在同一時(shí)間行免疫熒光染色，分別進(jìn)行NSE、GFAP、O4染色，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)NSCs分化為NSE陽性細(xì)胞、GFAP陽性細(xì)胞和O4陽性細(xì)胞的百分率。
　　 結(jié)果：NSCs分化為NSE陽性細(xì)胞的分化率從低到高依次為CON組，1 ATA-30 min組，1 ATA-6

14、0 min組，3 ATA-30 min組，2 ATA-30min組，3 ATA-60 min組，2 ATA-60 min組；除1 ATA-30min組與CON組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其余各HBO組與對(duì)照組之間的差異、同一壓力下60 min組與30 min組之間的差異及2 ATA-60 min組與其他各組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CON組、HBO組、NBH組、HIBH組、HIBH+HBO組NSCs分化為NSE陽

15、性細(xì)胞和O4陽性細(xì)胞的百分率依次增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與CON組或HBO組比較，NBH組、HIBH組、HIBH+HBO組NSCs分化為GFAP陽性細(xì)胞的百分率減少(P<0.01)。
　　 結(jié)論：HBO能夠促使離體NSCs分化為神經(jīng)元，條件為2ATA，60min穩(wěn)壓時(shí)作用最強(qiáng)。HBO、正常和HIBD新生大鼠的腦組織勻漿均能促進(jìn)離體NSCs向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，尤其對(duì)神經(jīng)元的分化作用以HBO+HIBD腦勻漿

16、為最強(qiáng)，其次為HIBD腦勻漿。提示HBO能夠增強(qiáng)HIBD腦勻漿中促分化因子的作用。正常和HIBD新生大鼠的腦組織勻漿能抑制離體NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。
　　 三、高壓氧影響NSCs分化的機(jī)制研究
　　 目的：近年研究發(fā)現(xiàn)，胚胎期神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)育不但與Wnt信號(hào)系統(tǒng)有密切聯(lián)系，BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也發(fā)揮著重要的作用。本部分實(shí)驗(yàn)擬檢測Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白，探討HBO影響NSCs分化的分子機(jī)制，為

17、HBO能更好的應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。
　　 方法：將傳至2-3代的NSCs分為5組(n=3)，即CON、HBO、NBH、HIBH和HIBH+HBO(具體處理同第二部分)，收集細(xì)胞，提取總蛋白、胞漿蛋白、核蛋白，分別檢測Wnt3蛋白、β-catenin蛋白、BMP2蛋白的活性；再將NSCs分為2組：①HBO組：NSCs給予HBO處理；②sFRP2/3+HBO組：加入sFRP2/3(Wnt蛋白的拮抗劑)，使其終濃度為500ng/m

18、l，然后給予HBO處理。HBO后繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集細(xì)胞，提取總蛋白、胞漿蛋白、核蛋白，分別檢測Wnt3蛋白、βーcatenin蛋白、BMP2蛋白的活性。
　　 結(jié)果：CON組、HBO組、NBH組、HIBH組、HIBH+HBO組Wnt3蛋白和BMP2蛋白的表達(dá)依次增加(P<0.05)；βーcatenin總蛋白的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，基本一致；β-catenin胞漿蛋白的表達(dá)依次減少(P<0.05)，而β-catenin

19、核蛋白的表達(dá)依次增加(P<0.05)。在加入sFRP2/3后，NSCs向神經(jīng)元細(xì)胞的分化減少(P<0.01)，βーcatenin的入核和BMP2蛋白的表達(dá)也明顯比對(duì)照組減少(P<0.05)。
　　 結(jié)論：Wnt-βーcatenin-BMP信號(hào)通路參與了HBO和HIBD腦勻漿促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化。
　　 結(jié)論：
　　 1.HBO可以促進(jìn)離體BMSCs向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，其機(jī)制可能與Wnt

20、3蛋白的活化有關(guān)。
　　 2.HBO能夠促進(jìn)離體NSCs分化為神經(jīng)元，條件為2ATA，60min穩(wěn)壓時(shí)作用最強(qiáng)。
　　 3.HBO、正常和HIBD新生大鼠的腦組織勻漿均能促進(jìn)離體NSCs向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，尤其對(duì)神經(jīng)元的分化作用以HBO+HIBD腦勻漿為最強(qiáng)，其次為HIBD腦勻漿。提示HBO能夠增強(qiáng)HIBD腦勻漿中促分化因子的作用。
　　 4.Wnt-β-catenin-BMP信號(hào)通路參與了HBO和HIB