中樞離斷兔股神經(jīng)干細(xì)胞源性神經(jīng)元細(xì)胞移植.pdf

1、研究目的：周?chē)窠?jīng)缺損的修復(fù)，是世界性的難題。主要是神經(jīng)生長(zhǎng)速度慢和效應(yīng)器、感受器萎縮快的矛盾。如何提高神經(jīng)再生的速度和質(zhì)量，尋找新的修復(fù)方法是周?chē)窠?jīng)損傷迫切需要解決的瓶頸問(wèn)題。目前周?chē)窠?jīng)缺損的治療策略，是依據(jù)周?chē)窠?jīng)損傷再生的理論，通過(guò)提供一個(gè)神經(jīng)纖維再生通道、營(yíng)造有利于神經(jīng)纖維再生微環(huán)境等，促進(jìn)神經(jīng)再生的，沒(méi)能解決神經(jīng)快速到達(dá)效應(yīng)器、感受器的問(wèn)題。鑒于此，我們提出了“橋接神經(jīng)元修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損”的設(shè)想，即通過(guò)神經(jīng)元接力的方法，加

2、快神經(jīng)到達(dá)效應(yīng)器、感受器的時(shí)間，減少效應(yīng)器、感受器病變程度，提高神經(jīng)損傷修復(fù)的效果。為驗(yàn)證此設(shè)想，我們實(shí)驗(yàn)室將種植非神經(jīng)干細(xì)胞性成體干細(xì)胞源性神經(jīng)元細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化神經(jīng)移植于鼠、犬外周神經(jīng)損傷缺損模型中，發(fā)現(xiàn)，支架材料上的非神經(jīng)干細(xì)胞性成體干細(xì)胞源神經(jīng)元細(xì)胞，可以在外周神經(jīng)微環(huán)境中存活、增殖、形成突觸聯(lián)系，促進(jìn)了神經(jīng)功能的修復(fù)。但是，種植在外周神經(jīng)中的成體干細(xì)胞源神經(jīng)元細(xì)胞，是促進(jìn)了新生軸突的生長(zhǎng)，還是建立了與中樞以及效應(yīng)器之間的連

3、接，缺乏有力的證據(jù)。為觀測(cè)非神經(jīng)干細(xì)胞性成體干細(xì)胞源性神經(jīng)元細(xì)胞，在外周神經(jīng)微環(huán)境中能否維持神經(jīng)元細(xì)胞的生理學(xué)功能，以及能否與效應(yīng)器（肌肉）形成連接，本課題擬將這種神經(jīng)元細(xì)胞種植于已與中樞離斷的家兔股神經(jīng)遠(yuǎn)端神經(jīng)干內(nèi)，通過(guò)研究種植細(xì)胞的演變及股四頭肌的狀況來(lái)評(píng)價(jià)“橋接神經(jīng)元修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損”設(shè)想的可行性。
　　 研究方法：本實(shí)驗(yàn)采用了骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞為種子細(xì)胞。從兔髂后上嵴獲取骨髓細(xì)胞后，分離、擴(kuò)增、無(wú)血清培養(yǎng)，并使用化學(xué)

4、誘導(dǎo)的方法向神經(jīng)元方向進(jìn)行誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)48小時(shí)后，神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物Nestin、β-Ⅲ tubulin、synapsin Ⅰ、S-100、GFAP的免疫細(xì)胞熒光化學(xué)染色鑒定。實(shí)驗(yàn)分3組。實(shí)驗(yàn)組，家兔右下肢在股神經(jīng)皮支與肌支的交匯處上方0.5cm 處剪斷神經(jīng)。遠(yuǎn)側(cè)斷端，神經(jīng)離斷處去除1mm 神經(jīng)軸索，結(jié)扎后，縫扎于腹股溝韌帶上；去神經(jīng)軸索處，種植1×104的誘導(dǎo)性神經(jīng)元細(xì)胞；對(duì)照組同部位注射等量細(xì)胞培養(yǎng)液；假手術(shù)組，兔左

5、下肢，手術(shù)暴露股神經(jīng)。觀察兔實(shí)驗(yàn)后肢運(yùn)動(dòng)情況；術(shù)后5、7、 9、11、12、14、19、23、24、26周用電刺激外周神經(jīng)干的方法檢查肌肉的興奮性以及神經(jīng)傳導(dǎo)（復(fù)合肌肉動(dòng)作電位，CAMP）；細(xì)胞移植后26周處死動(dòng)物，取材，光鏡、透射電鏡觀測(cè)形態(tài)結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)檢測(cè)NF-M、S-100、NeuN、ChAT，甲苯胺藍(lán)染色觀察髓鞘形成。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)向神經(jīng)元方向誘導(dǎo)后，細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)，部分細(xì)胞伸出

6、軸突樣突起，免疫細(xì)胞熒光化學(xué)顯示神經(jīng)元特異性的表面抗原Nestin、β-Ⅲ tubulin、synapsin Ⅰ表達(dá)陽(yáng)性，膠質(zhì)細(xì)胞特異性的表面抗原S-100、GFAP 則基本不表達(dá)。細(xì)胞移植后第5周微弱的復(fù)合肌肉動(dòng)作電位（CAMP）出現(xiàn)，CAMP的波幅隨手術(shù)恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步增大，兩者具有線性相關(guān)關(guān)系。術(shù)后26周，實(shí)驗(yàn)組，神經(jīng)干內(nèi)細(xì)胞，神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NF-M、NeuN 染色陽(yáng)性，少數(shù)細(xì)胞膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元標(biāo)志物ChAT 染色為陽(yáng)性，

7、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物S-100染色陽(yáng)性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)干內(nèi)形成了有髓神經(jīng)纖維，但是密度明顯低于假手術(shù)組；實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元軸突結(jié)構(gòu)被雪旺細(xì)胞形成的髓鞘所包裹，髓鞘周?chē)逋暾谳S突結(jié)構(gòu)內(nèi)觀察到了線粒體樣細(xì)胞器，但髓鞘的厚度差別很大。
　　 結(jié)論：
　　 1.骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞可以作為移植神經(jīng)元細(xì)胞的來(lái)源。
　　 2.中樞離斷周?chē)窠?jīng)動(dòng)物模型，由于排除了中樞神經(jīng)和新生軸突的影響，可以作為評(píng)價(jià)周?chē)窠?jīng)神經(jīng)元細(xì)胞移植效果