神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子聯(lián)合脂肪源性神經(jīng)干細(xì)胞移植治療AD模型鼠的研究.pdf

1、1.目的：分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞及對(duì)其鑒定
　　方法：取出大鼠腹股溝區(qū)脂肪，建立脂肪干細(xì)胞（ADSCs）培養(yǎng)和傳代的方法，利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞表型和細(xì)胞周期鑒定，誘導(dǎo)ADSCs定向分化成骨，誘導(dǎo) ADSCs定向分化成細(xì)胞球，并對(duì)細(xì)胞球進(jìn)行 Nestin染色，隨后，再誘導(dǎo)細(xì)胞球7天，進(jìn)行GFAP、MAP2和β-TubulinⅢ熒光染色來鑒定分化的細(xì)胞。
　　結(jié)果：培養(yǎng)出的脂肪干細(xì)胞，能夠進(jìn)行增殖和傳代。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)的對(duì) A

2、DSCs表型測(cè)定，CD29(92.69)％，CD90(92.69)%；CD44(64.41)%；CD45(0.20)%。細(xì)胞周期測(cè)定，顯示細(xì)胞大多數(shù)處于靜止期，具有較強(qiáng)的分裂增殖能力，通過成骨堿性磷酸酶染色（+），證明ADSCs可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為骨細(xì)胞，Nestin染色（+）、熒光染色GFAP（+）、MAP2（+）和β-TubulinⅢ（+），證明ADSCs可以誘導(dǎo)出NSCs細(xì)胞球，并可以分化成NSCs、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元。
　　結(jié)

3、論：可以成功分離培養(yǎng)ADSCs，并可以使其分化為骨細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元。
　　2.目的：用NGF和BDNF誘導(dǎo)脂肪源性NSCs分化，比較單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)脂肪源性NSCs分化成神經(jīng)元的差別，同時(shí)檢測(cè)分化過程中相關(guān)基因的改變。
　　方法：將P2代脂肪源性NSCs分為4組：(1)對(duì)照組，(2) NGF誘導(dǎo)組，(3) BDNF誘導(dǎo)組，(4)NGF+BDNF聯(lián)合誘導(dǎo)組。誘導(dǎo)分化7d后，免疫熒光檢測(cè)各組MAP2和β-

4、TubulinⅢ的細(xì)胞陽性率。誘導(dǎo)分化3 d和7 d時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞RNA被提取，檢測(cè)各組MASH1，NGN1，NeuroD，HES1和HES5的相對(duì)表達(dá)量（用Q-PCR方法）。
　　結(jié)果：?jiǎn)为?dú)使用NGF或BDNF都可以誘導(dǎo)神經(jīng)元分化。誘導(dǎo)7 d時(shí)，MAP2陽性細(xì)胞比例分別為：NGF組為21.23±1.87%，BDNF組為22.48±2.06%；BDNF和NGF組為26.54±3.21%。β-Tubulin III陽性細(xì)胞比例分別為：

5、NGF組為26.41±1.52%，BDNF組為32.58±2.37%；BDNF和NGF組為40.32±3.08%。聯(lián)合誘導(dǎo)組比單獨(dú)因子誘導(dǎo)組（NGF組或者BDNF組）神經(jīng)元分化更多。Q-PCR結(jié)果示，誘導(dǎo)分化后，發(fā)現(xiàn) MASH1、NeuroD和NGN1表達(dá)量都被提升了，聯(lián)合誘導(dǎo)組比單獨(dú)因子誘導(dǎo)組（NGF組或BDNF組）表達(dá)量高。
　　結(jié)論：聯(lián)用NGF和BDNF對(duì)脂肪源性NSCs分化為神經(jīng)元有更好的促進(jìn)作用。
　　3.目的：探

6、討不同條件下的細(xì)胞移植對(duì)AD模型的影響。
　　方法：分為5組大鼠，Normal group，ADgroup，NGFgroup，BDNFgroup，Combined group。用免疫毒素192-IgG-saporin注射動(dòng)物，建模后3周，NTF和脂肪源性NSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)3d后的混合細(xì)胞，被移植到AD動(dòng)物體內(nèi)。4周以后，對(duì)各組進(jìn)行水迷宮行為學(xué)測(cè)試，檢測(cè)膽堿能神經(jīng)元數(shù)量、海馬突觸素及AChE陽性纖維密度。
　　結(jié)果：各細(xì)胞移植組

7、都改善了 AD模型的行為學(xué)指標(biāo)。聯(lián)合組的 VDB膽堿能神經(jīng)元數(shù)量84.08±6.48，MS膽堿能神經(jīng)元數(shù)量為32.12±2.57；和單因子NGF或者BDNF比較(P<0.05)。聯(lián)合組海馬CA1區(qū)的突觸素OD值和AChE陽性纖維數(shù)量，分別為0.271±0.013和186.09±2.32；和單因子NGF或者BDNF比較，(P<0.05)。
　　結(jié)論：兩個(gè)因子（NGF和BDNF）聯(lián)用誘導(dǎo)脂肪源性NSCs3天后的混合細(xì)胞，移植到AD模型