高壓氧治療對(duì)新生鼠缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)干細(xì)胞變化規(guī)律探討.pdf

1、[研究背景]新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemicbraindamage，HIBD)是圍產(chǎn)期缺氧缺血引起的胎兒和新生兒腦損傷性疾病，是圍產(chǎn)期窒息所致的嚴(yán)重并發(fā)癥，是導(dǎo)致兒童神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的常見原因之一，往往引起新生兒死亡、腦性癱瘓、癲癇以及智力低下，常常留有嚴(yán)重的后遺癥，嚴(yán)重威脅兒童的身心健康，是造成兒童傷殘的主要原因之一，往往給社會(huì)和家庭帶來了沉重負(fù)擔(dān)。積極防治HIBD對(duì)減少病死率及神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生具有重要的臨床意

2、義，而復(fù)制與人類HIBD相近的動(dòng)物模型是上述研究的一個(gè)重要基礎(chǔ)，對(duì)深入研究HIBD的病理生理過程、發(fā)病機(jī)制，從而對(duì)HIBD進(jìn)行臨床及實(shí)驗(yàn)室研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)Rice法[1]、阻斷雙側(cè)子宮動(dòng)脈、離斷子宮以阻斷血流等方法制作新生大鼠HIBD模型，通過觀察其成活率、體重增長率、行為能力變化及病理改變等指標(biāo)，對(duì)這幾種建立模型的方法進(jìn)行比較，為新生兒HIBD的研究打下良好的基礎(chǔ)。 目前HIBD的發(fā)病機(jī)理還不是很明朗，其

3、臨床療效也很不近人意。因此，深入研究HIBD的發(fā)病機(jī)理仍然是該病尋求有效治療方案的根本途徑。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺氧缺血是造成永久性腦損傷的原因之一，其中室管膜下區(qū)(subventricularzoneSVZ)的NSCs對(duì)缺氧缺血最敏感，缺氧缺血后細(xì)胞相繼壞死、凋亡[2]。本研究在建立新生鼠HIBD動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，采用免疫組化、細(xì)胞培養(yǎng)及光鏡技術(shù)，闡明高壓氧(hyperbaricoxygenation，HBO)后HIBD病程中NSCs的變化規(guī)

4、律，為臨床有效地治療HIBD提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 高壓氧是指機(jī)體在高氣壓環(huán)境中所呼吸的與環(huán)境等壓的純氧，由于HBO能明顯得增加機(jī)體對(duì)氧的攝取和利用，使血氧含量增加，血氧分壓增高，氧彌散能力增強(qiáng)，增加機(jī)體對(duì)氧的攝取和利用，改善全身和腦組織的缺氧狀況，還可使腦血管收縮、腦血液量減少，減輕組織水腫，顱內(nèi)壓降低，因而HBO被用于臨床治療各種缺氧性疾病治療：如CO中毒、潛水減壓病、厭氧菌感染性疾病、顱腦損傷、脊髓損傷、各種缺氧缺血所致組織

5、損傷性疾病，取得了顯著療效。但學(xué)者對(duì)HBO的作用存在兩種不同的觀點(diǎn)：一些學(xué)者認(rèn)為，高壓氧通過上述機(jī)制對(duì)這些疾病發(fā)揮治療作用。而另一些學(xué)者則認(rèn)為HBO具有神經(jīng)毒作用，可加重缺氧缺血后組織的氧化應(yīng)激損傷，使氧自由基的產(chǎn)生增加，加速神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡；甚至引起機(jī)體氧中毒。因此，本實(shí)驗(yàn)試圖通過對(duì)HBO后HIBD病程中神經(jīng)干細(xì)胞的變化規(guī)律探討，對(duì)HBO對(duì)HIBD的臨床治療提供有力的理論依據(jù)。 [研究目的]1.通過對(duì)幾種建立HIBD動(dòng)物模

6、型方法的比較，探討制作新生鼠HIBD模型的適宜方法。 2.探討HBO對(duì)HIBD模型鼠大腦神經(jīng)干細(xì)胞的作用規(guī)律。 [實(shí)驗(yàn)方法]1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象健康SD(Sprague-dawley)孕鼠及新生7日SD乳鼠，符合國家二級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)，由第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 2.實(shí)驗(yàn)分組與處理2.1.孕鼠隨機(jī)分為四組：斷離子宮組(A)、阻斷子宮血管組(B)、自然分娩組及其出生的新生7日SD乳鼠。前二組又根據(jù)血流阻斷時(shí)間的不同分為5、

7、10、15分鐘三組。自然分娩組出生的小鼠，除對(duì)照者(D)外，其余均在生后7天行左頸總動(dòng)脈結(jié)扎及8％氧氮混合氣吸入(C)。A、B組小鼠分別在出生后的第1、3、5、7、14、21天處死取腦。C組也于缺氧缺血處理后第1、3、5、7、14、21天處死取腦。 2.2.阻斷子宮血流10分鐘組及正常分娩組出生的小鼠分別于出生后6、48、96小時(shí)給予2.0ATA的高壓氧治療7天。高壓氧結(jié)束后的1、3、5、7、14、21d處死取腦。另外從每小組中

8、隨機(jī)選取2只，于處死前8小時(shí)，按200mg/kgBrdu，腹腔注射，進(jìn)行Brdu標(biāo)記[3]。 3.觀察指標(biāo)3.1.模型制作后觀察以下指標(biāo)：(1)計(jì)數(shù)每組的存活、死亡例數(shù)及死亡率；(2)行為觀察：于HIBD模型制作完成后1，3，5，7，14，21天觀察每只小鼠的行為能力，包括：翻身能力、平衡能力、爬行能力、四肢肌張力及有無抽搐；(3)體重測定：造模成功后每天上午8～10時(shí)測量每只小鼠體重，觀察其體重增長情況；(4)HE染色。

9、 3.2.HBO療程結(jié)束后觀察以下指標(biāo)：(1)HE染色；(2)SABC免疫組化染色檢測各組SD鼠腦組織Nestin蛋白表達(dá)陽性NSCs并定量；(3)SABC免疫組化染色檢測各組SD鼠腦組織Brdu表達(dá)陽性NSCs并定量；(4)SABC免疫組化染色檢測各組SD鼠腦組織Brdu和Nestin蛋白表達(dá)雙陽性NSCs并定量；(5)SD鼠NSCs的體外培養(yǎng)及鑒定。 [結(jié)果]1.斷離子宮組及阻斷子宮血流組小鼠“圍產(chǎn)期”死亡率高于其它正常分

10、娩組，且隨著阻斷子宮動(dòng)脈血供時(shí)間的延長，胎鼠的死亡率增高。且斷離子宮組出生的小鼠比相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的其它組死亡率更高，多在出生后24小時(shí)即死亡，而阻斷子宮血流5分鐘組與正常分娩組出生的小鼠，在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)其死亡率比較無顯著性差異(P＞0.05)。 2.阻斷子宮血供的孕鼠，血流阻斷后約1分鐘即見胎動(dòng)增加，持續(xù)約5分鐘后則出現(xiàn)胎動(dòng)減少，8分鐘時(shí)可見胎盤瘀血，若超過10分鐘(平均12分鐘)則可出現(xiàn)胎盤出血，甚至與子宮剝離而造成死胎或母鼠大出

11、血死亡。 3.乳鼠進(jìn)入密閉缺氧艙后不久即出現(xiàn)不同程度的缺氧癥狀：約3～5分鐘出現(xiàn)躁動(dòng)不安、翻滾，約10min，全身皮膚發(fā)紺、呼吸加深加快，20-30min站立不穩(wěn)，爬行時(shí)右后肢呈拖步，并逐漸出現(xiàn)全身肌肉顫動(dòng)、頭顫、不能翻身、自發(fā)或夾尾左旋、抽搐、甚至昏迷等表現(xiàn)，35-60min活動(dòng)明顯減少，個(gè)別于缺氧30～60分鐘后死亡。復(fù)氧后1h大部分表現(xiàn)為自發(fā)或夾尾向左側(cè)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。 4.斷離子宮組、阻斷子宮血流10、15分鐘組存活者

12、出生后體重增長緩慢。斷離子宮組出生后體重增長更慢，甚至體重不增。而阻斷子宮血流5分鐘組與正常分娩組出生的小鼠，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)其體重增長無顯著性差別，(P＞0.05)。 5.各組小鼠運(yùn)動(dòng)能發(fā)育明顯落后于正常分娩組，其翻身均在出生7天后，而爬行出窩則在約出生后11天，在發(fā)育過程中出現(xiàn)或輕或重的腦癱表現(xiàn)：反應(yīng)差、激惹或嗜睡、瞳孔縮小或不對(duì)稱、肌張力增高或低下，甚至驚厥、死亡，斷離子宮組癥狀更明顯。而阻斷血流5分鐘組與正常分娩組比較無顯著

13、性差異。 6.肉眼觀可見斷離子宮組與阻斷子宮血流10、15分鐘組出生的小鼠，于7天后處死時(shí)可見腦溝回加深，呈腦萎縮征象。HE染色于生后24h可見大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦出現(xiàn)大片壞死，胞體顯著腫脹，核漿分界不清，細(xì)胞溶解、消失；72小時(shí)即可見典型的缺氧缺血性腦損傷改變，細(xì)胞體縮小，胞漿呈均勻的嗜伊紅染色，胞核濃縮深染，結(jié)構(gòu)消失。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞周圍水腫，間隙增大，形成多發(fā)的水腫灶、壞死灶，同時(shí)伴有出血。7天時(shí)已可見大腦半球神經(jīng)元丟失、死亡

14、，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生，呈網(wǎng)狀及索條狀，瘢痕形成。14d、21d神經(jīng)元大量丟失，皮層、紋狀體、海馬、丘腦等部位形成膠質(zhì)瘢痕。而HBO組神經(jīng)細(xì)胞的壞死及變性程度較HIBD組輕，腦組織神經(jīng)細(xì)胞的排列較整齊，神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)也較完整。 7.Nestin蛋白陽性表達(dá)呈棕黃色，位于NSCs胞漿內(nèi)，呈棕黃色，胞核成空泡狀，細(xì)胞呈大小不等的圓形，分布于大腦半球的皮質(zhì)、海馬、側(cè)腦室室管膜下區(qū)等，在1d、3d處死時(shí)間點(diǎn)陽性NSCs較多，此后開始下降，2

15、1d處死時(shí)間點(diǎn)時(shí)最少。各時(shí)間點(diǎn)均可在側(cè)腦室室管膜和室下區(qū)檢測出Nestin陽性NSCs。僅行高壓氧處理組的小鼠，Nestin蛋白陽性NSCs檢出率比其它組均高。缺氧缺血加高壓氧治療組Nestin蛋白陽性NSCs檢出率比對(duì)照組降低，比單純高壓氧組明顯降低，而高于單純?nèi)毖跞毖獰o高壓氧治療組，而出生后48h行高壓氧治療組其Nestin蛋白陽性NSCs檢出率高于6h及96h組；6h組高于96h組。單純?nèi)毖跞毖MNestin蛋白陽性NSCs檢出率

16、比其它各組均低。 8.Brdu陽性細(xì)胞鏡下觀可見成橢圓形或不規(guī)則形，胞體較大，核膜核仁明顯，深染成黃棕色，核仁深染、可見分裂相，這些細(xì)胞主要見于側(cè)腦室室管膜下區(qū)(SVZ)，在雙側(cè)大腦半球均可見到，在小血管周圍也可見有分布。在1d、3d、5d處死時(shí)間點(diǎn)陽性Brdu細(xì)胞較多，此后開始下降，21d處死時(shí)間點(diǎn)Brdu陽性細(xì)胞最少，隨著年齡的增大呈減少趨勢。 9.在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞為圓形亮點(diǎn)，折光性強(qiáng)，，8h后

17、細(xì)胞開始貼壁，胞體隨之變形成三角形、錐形及星形，第2d和第3d，細(xì)胞懸液中可見許多由2-4個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，隨后細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞數(shù)目快速增加，形成細(xì)胞密度較高的克隆細(xì)胞球，不同時(shí)間點(diǎn)的SD鼠的左側(cè)腦組織，均能獲得克隆細(xì)胞球，但隨著時(shí)間的延長培養(yǎng)液中的克隆細(xì)胞球漸減少，缺血缺氧組培養(yǎng)出的克隆細(xì)胞球最少。 [結(jié)論]1.阻斷子宮血流、離斷孕鼠子宮、結(jié)扎新生鼠左頸總動(dòng)脈加低濃度氧氣吸入均可復(fù)制HIBD的動(dòng)物模型。而阻斷子宮血流10分鐘的