EGCG對(duì)小鼠合子基因組激活和干細(xì)胞因子Sox2與Oct4表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　觀察表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）對(duì)小鼠體外發(fā)育1-細(xì)胞胚至2-細(xì)胞胚過(guò)渡的影響，研究EGCG對(duì)小鼠合子基因組激活和干細(xì)胞因子Sox2與Oct4表達(dá)水平的改變，為進(jìn)一步探討EGCG影響小鼠植入前胚體外發(fā)育的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.以空白M16培養(yǎng)液為對(duì)照組，在 M16中添加濃度為10μg/ml、20μg/ml EGCG為實(shí)驗(yàn)組，收集昆明（kunming，KM）小鼠1-細(xì)胞胚（hC

2、G后21h）。
　　（1）進(jìn)行體外連續(xù)培養(yǎng)，計(jì)數(shù)各組發(fā)育至2-細(xì)胞胚、4-細(xì)胞胚、桑葚胚和囊胚的數(shù)目，并以1-細(xì)胞胚為基數(shù)，計(jì)算各組至不同階段的發(fā)育率。
　?。?）M16組及20μg/ml EGCG組的1-細(xì)胞胚體外培養(yǎng)至hCG后33h，利用熒光顯微鏡分別對(duì)磷酸化組蛋白H3陽(yáng)性和陰性的1-細(xì)胞胚數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)2-細(xì)胞胚數(shù)量，觀察EGCG對(duì)1-細(xì)胞胚至2-細(xì)胞胚過(guò)渡的影響。
　　2.取hCG后21h

3、1-細(xì)胞胚分別在M16及20μg/ml EGCG培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)至hCG后27h，收集1-細(xì)胞胚。
　?。?）激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè) eIF1A、ZSCAN4、SOX2和OCT4蛋白的表達(dá)定位情況。
　?。?）Realtime-PCR檢測(cè)合子基因組激活相關(guān)基因eIF1A、Zscan4d、MuERV-L、Hsp70.1及干細(xì)胞因子Sox2與Oct4的mRNA水平。
　　3.取hCG后27h1-細(xì)胞胚分別在M16及20μ

4、g/ml EGCG培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)至hCG后45h，收集2-細(xì)胞胚。
　　（1）激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè) eIF1A、ZSCAN4、SOX2和OCT4蛋白的表達(dá)定位情況。
　?。?） Realtime-PCR檢測(cè)合子基因組激活相關(guān)基因eIF1A、Zscan4d、MuERV-L、Hsp70.1及干細(xì)胞因子Sox2與Oct4的mRNA水平。
　　結(jié)果：
　　1.添加EGCG實(shí)驗(yàn)組的1-細(xì)胞胚體外培養(yǎng)各階段的發(fā)育率明顯

5、高于M16組。添加20μg/ml EGCG的實(shí)驗(yàn)組1-細(xì)胞胚至2-細(xì)胞胚的過(guò)渡率明顯高于對(duì)照組（P<0.01），且未到2-細(xì)胞胚的1-細(xì)胞胚發(fā)育至 M期的比率也高于M16組（P<0.05）。
　　2.體外培養(yǎng)的1-細(xì)胞胚（hCG后21h至27h）：
　　（1）激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示：EGCG組1-細(xì)胞胚核內(nèi)ZSCAN4和SOX2熒光染色相對(duì)強(qiáng)度明顯高于M16組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而1-細(xì)胞胚核內(nèi)e

6、IF1A和OCT4熒光染色相對(duì)強(qiáng)度略高于 M16組，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　（2）Realtime-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：EGCG組合子基因組激活相關(guān)基因Zscan4d、MuERV-L、Hsp70.1及干細(xì)胞因子 Oct4的mRNA表達(dá)水平均高于M16組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。eIF1A和Sox2的mRNA表達(dá)水平略高于M16組，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.體外培養(yǎng)的2-細(xì)胞胚（hCG后27

7、h至45h）：
　　（1）激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示：EGCG組2-細(xì)胞胚核內(nèi)ZSCAN4和OCT4熒光染色相對(duì)強(qiáng)度明顯高于M16組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），2-細(xì)胞胚核內(nèi)eIF1A和SOX2熒光染色相對(duì)強(qiáng)度略高于M16組，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　（2）Realtime-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：EGCG組合子基因組激活相關(guān)基因MuERV-L、Hsp70.1及干細(xì)胞因子Oct4的mRNA表達(dá)水平

8、高于M16組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。eIF1A、Zscan4d及Sox2的mRNA表達(dá)水平略高于M16組，差異都無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論
　　EGCG可以顯著提高小鼠胚胎體外發(fā)育1-細(xì)胞胚至2-細(xì)胞胚的過(guò)渡率， 促進(jìn)植入前胚早期的細(xì)胞周期進(jìn)程。EGCG組1-細(xì)胞胚內(nèi)合子基因組激活相關(guān)基因Zscan4d、MuERV-L、Hsp70.1以及干細(xì)胞因子Oct4的mRNA水平明顯高于M16組，