大鼠氣管干細(xì)胞增殖分化過程中Oct3-4、Nanog和Sox2的表達(dá)及意義.pdf

1、干細(xì)胞是存在于胚胎和成體中的一類特殊細(xì)胞，它能長(zhǎng)期的自我更新，在特定的條件下具有分化形成多種終末細(xì)胞的能力。成體干細(xì)胞為存在特定組織中的干細(xì)胞，由于無倫理學(xué)方面的困擾，成體干細(xì)胞的應(yīng)用越來越受到人們的關(guān)注。隨之成體干細(xì)胞增殖分化調(diào)控的機(jī)制也成為研究的重點(diǎn)，有學(xué)者提出胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因的概念，包括：Oct3/4、Nanog和Sox2等。它們?cè)谂咛ジ杉?xì)胞中有表達(dá)，而在成熟組織細(xì)胞中無表達(dá)。這些胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因可以維持胚胎干細(xì)胞未分化狀態(tài)，

2、保持干細(xì)胞的多向分化潛能。另外，Oct3/4、Nanog和Sox2的激活能使體細(xì)胞發(fā)生再編程，表現(xiàn)出未分化細(xì)胞特征，使其具有干細(xì)胞多潛能分化的能力，為成體干細(xì)胞應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。 氣管上皮在正常情況下更新緩慢，但在損傷修復(fù)時(shí)能再生以維持其完整性，這說明氣管上皮中存在干細(xì)胞，只有在損傷的過程中才能激活其潛能。我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了5—FU引發(fā)離體氣管損傷修復(fù)模型，這一模型成功再現(xiàn)了氣管干細(xì)胞的增殖分化過程，使氣管干細(xì)胞增殖分化機(jī)制的

3、初步研究成為可能。因5—FU屬抗嘧啶類代謝藥，經(jīng)5—FU作用后，氣管上皮增殖期細(xì)胞脫落，基底膜上殘留的細(xì)胞為GO期細(xì)胞，并出現(xiàn)了干細(xì)胞標(biāo)記物ABCG2的表達(dá)，撤除5—FU后氣管上皮經(jīng)扁平細(xì)胞、立方細(xì)胞，直至48小時(shí)恢復(fù)到假復(fù)層纖毛柱狀上皮，證明氣管干細(xì)胞存在于對(duì)5—FU抗性GO期細(xì)胞中。但對(duì)這一過程的調(diào)控機(jī)制還所知甚少。 本研究利用5—FU引發(fā)離體氣管損傷修復(fù)模型，觀察在氣管干細(xì)胞增殖分化過程中Oct3/4、Nanog和Sox2

4、的動(dòng)態(tài)變化，并探討其維持氣管干細(xì)胞未分化狀態(tài)的分子機(jī)制。 材料和方法： 一、離體大鼠氣管損傷修復(fù)模型的制備及5—azaC處理 取約200克左右的Wistar大鼠，雌雄不限，水合氯醛麻醉，無菌條件下取出氣管，PBS沖洗，置于DMEM/F12培養(yǎng)液中(含10％胎牛血清)。取正常氣管，剪取一氣管環(huán)固定，留做石蠟切片，灌入蛋白酶ⅩⅣ(0.5mg/ml)，結(jié)扎另一端，4℃消化過夜，收集消化液，加FBS至終濃度為2.5％終止

5、酶反應(yīng)收集正常氣管上皮細(xì)胞子2mlEppendorf管中，—70℃凍存，留做mRNA提取。其余氣管組織分為5—FU作用組和5—azaC處理組。5—FU作用組為5—FU作用12小時(shí)后，置于DMEM/F12培養(yǎng)液中(含10％胎牛血清)，分別于換液后0、3、6、12、24、48小時(shí)取出氣管組織分別固定，留做石蠟切片；5—azaC處理組在5—FU作用后，當(dāng)換液后24小時(shí)，換為含有1μM5—azaC DMEM/F12(含10％胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)，

6、方法同上，6小時(shí)后取出氣管組織分別固定，留做石蠟切片；消化，收集細(xì)胞于2mlEppendorf管中，—70℃保存，以備DNA，RNA和蛋白提取。 二、RT-PCR檢測(cè) 按TizolTM試劑使用說明提取氣管上皮細(xì)胞總RNA，檢測(cè)它的濃度，純度和完整性。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明操作，選用Oligo—dT做引物合成第一鏈cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：30℃10min，40℃40min，99℃5min，5℃5nun；PCR反應(yīng)條件為：9

7、4℃變性2min后，94℃30s，退火，72℃1min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色分析表達(dá)結(jié)果，測(cè)灰度值，統(tǒng)計(jì)。相同條件下用β—actin作為內(nèi)對(duì)照。 三、蛋白印跡檢測(cè) 按蛋白抽提試劑盒說明抽提氣管上皮細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳，50V恒壓濕轉(zhuǎn)120mins，BSA室溫封閉2hrs，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育2hrs，DAB顯色。轉(zhuǎn)膜后各步之間均用洗

8、膜液洗膜3次，每次5mins。相同條件下用β—actin作為內(nèi)對(duì)照。 四、間接免疫熒光檢測(cè)氣管上皮Oct3/4，Nanog和Sox2的表達(dá) 石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，非免疫動(dòng)物血清封閉，一抗分別為山羊抗Oct3/4，兔抗Nanog和山羊抗Sox2；二抗分別TRITC標(biāo)記兔抗羊IgG和FITC標(biāo)記羊抗兔IgG。DAPI復(fù)染細(xì)胞核。50％緩沖甘油封片，熒光顯微鏡OlympasBX51下觀察并照相。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：用等量的0.

9、01mol/L PBS代替一抗，其余步驟同前。 五、免疫組化檢測(cè)氣管上皮CK14和P63的表達(dá) 石蠟切片脫蠟至水，高溫高壓抗原修復(fù)，非免疫動(dòng)物血清封閉，一抗分別為山羊抗CK14和山羊抗P63，4℃孵育過夜；二抗37℃孵育30min。DAB顯色。顯微鏡下觀察并照相。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：用等量的0.01mol/L PBS代替一抗，其余步驟同前。 六、甲基化特異性PCR檢測(cè) 以酚—氯仿抽提法提取氣管上皮細(xì)胞DNA，參

10、見試劑盒說明進(jìn)行甲基化修飾，然后進(jìn)行甲基化特異性PCR(MSPCR)反應(yīng)，MSPCR反應(yīng)條件為：95℃變性3min后，98℃10s，退火，72℃1min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色分析表達(dá)結(jié)果，測(cè)灰度值，統(tǒng)計(jì)。 七、統(tǒng)計(jì)分析 所有的RT-PCR實(shí)驗(yàn)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次，所得數(shù)據(jù)的值用均數(shù)(means)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)來表示。用SPSS11.5軟件對(duì)所得

11、數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、5—FU誘導(dǎo)損傷修復(fù)過程中CK14、P63和Oct3/4的表達(dá)變化 正常氣管上皮幾乎沒有Oct3/4的表達(dá)，去除5—FU作用后Oh，Oct3/4少量表達(dá)，隨后表達(dá)量逐漸增高，至6h達(dá)到峰值，隨后逐漸降低，至48小時(shí)幾乎恢復(fù)至正常水平；正常氣管上皮CK14和P63高表達(dá)，去除5—FU作用后Oh，CK14和P63幾乎不表達(dá)，之后表達(dá)逐漸增加，至48

12、h幾乎恢復(fù)正常水平。 2、間接免疫熒光檢測(cè)5—FU作用后大鼠氣管上皮Oct3/4、Nanog和Sox2的表達(dá) 正常氣管上皮幾乎沒有Oct3/4、Nanog和Sox2的表達(dá)，5—FU打擊后0h，出現(xiàn)Oct3/4、Nanog和Sox2陽性細(xì)胞，隨后逐漸增多，至6h達(dá)到高峰，隨后逐漸降低，至48h幾乎恢復(fù)至正常水平。Oct3/4、Nanog和Sox2的定位相同，均位于相同的細(xì)胞中。 3、5—FU誘導(dǎo)損傷修復(fù)過程中Oct

13、3/4、Nanog和Sox2的表達(dá)變化 蛋白印跡檢測(cè)大鼠氣管上皮損傷修復(fù)過程中Oct3/4、Nanog和Sox2的蛋白水平發(fā)現(xiàn)，正常氣管上皮沒有Oct3/4、Nanog和Sox2表達(dá)。5—FU打擊后0h，出現(xiàn)Oct3/4、Nanog和Sox2的表達(dá)，并隨著氣管上皮的修復(fù)逐漸增加，在6h達(dá)到高峰，隨后逐漸降低，至48h降至正常水平。RT-PCR的結(jié)果與蛋白印跡的結(jié)果相同。 4、MSPCR檢測(cè)5—FU作用后大鼠氣管上皮Oct

14、3/4、Nanog和Sox2的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài) 選取幾個(gè)有代表性的時(shí)間點(diǎn)，分別選取正常氣管上皮細(xì)胞、5—FU作用后0h的細(xì)胞、5—FU作用后恢復(fù)6h的細(xì)胞和恢復(fù)48h的氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示在正常氣管上皮細(xì)胞中僅存在三種基因的甲基化條帶，而5—FU作用后0h和6h出現(xiàn)了這三種基因的甲基化和未甲基化條帶，48h也只有三種基因的甲基化條帶。 5、5—azaC處理對(duì)大鼠氣管上皮損傷修復(fù)的影響 HE染色顯示，5

15、—FU誘導(dǎo)損傷后，氣管上皮細(xì)胞恢復(fù)24h出現(xiàn)分化時(shí)用5—azaC作用，與單純5—FU作用對(duì)照組相比，氣管上皮的形態(tài)出現(xiàn)差異。單純5—FU作用對(duì)照組，氣管上皮于30h后出現(xiàn)雙層，而5—azaC作用組，氣管上皮呈現(xiàn)扁平細(xì)胞。 免疫熒光結(jié)果檢測(cè)Oct3/4、Nanog和Sox2的表達(dá)，5—azaC作用組Oct3/4、Nanog和Sox2陽性的細(xì)胞數(shù)明顯高于單純5—FU作用組。RT-PCR與熒光結(jié)果相同。 結(jié)論： 1、5