曲古抑菌素A對大鼠氣管干細(xì)胞增殖分化的影響.pdf

1、目的： 目前，在氣管干細(xì)胞研究中，我們建立了氟脲嘧啶(Fluorouracil，5-Fu)引發(fā)離體氣管損傷修復(fù)模型，論證了氣管干細(xì)胞位于具有5-Fu抗性的GO期細(xì)胞中。為闡明氣管干細(xì)胞增殖分化的調(diào)控機(jī)制，我們已檢測了wnt信號中的wnt1，β-catenin，cyclinD1等成員在氣管干細(xì)胞增殖分化過程中的時(shí)空變化情況，證明了Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑參與調(diào)控氣管干細(xì)胞增殖分化全過程。另外，我們還觀察到了HDAC1

2、在氣管干細(xì)胞增殖分化過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。本文結(jié)合前段我研究組工作基礎(chǔ)，利用TSA抑制HDAC1的作用，采用形態(tài)學(xué)、免疫組化及western blotting方琺觀察其在5-Fu模型中對氣管干細(xì)胞增殖分化的影響。 方法： 1、制備氣管損傷模型及剝離上皮 取約200克左右的Wistar大鼠，雌雄不限(中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，腹腔注射10％水合氯醛0.4ml/100g，無菌條件下取出氣管，無菌PBS反復(fù)沖洗，

3、洗凈血液和粘液，置于DMEM/F12培養(yǎng)液中(含10％胎牛血清)，于培養(yǎng)液中加入終濃度為100mg/ml的5-Fu，37℃，5％CO2孵育12小時(shí)，棄去上述培養(yǎng)液，換成新鮮DMEM/F12液(含10％胎牛血清)，同時(shí)加入終濃度為200nM的TsA繼續(xù)培養(yǎng)，于換液后3、6、12、24、48小時(shí)分別10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制成4μm厚的組織切片。同時(shí)各時(shí)間點(diǎn)取氣管組織，放于Eppendorf管中，-70℃保存。 2、HE染

4、色動(dòng)態(tài)觀察各時(shí)間點(diǎn)氣管粘膜上皮組織學(xué)形態(tài)改變。 3、利用免疫組織化學(xué)染色觀察沒有TSA作用時(shí)HDAC1在5-Fu模型中的表達(dá)。 4、Western blotting檢測TSA對各時(shí)問點(diǎn)HDAC1的表達(dá)量變化的影響。 結(jié)果： 1、HE：在沒有TSA作用情況下，去除5-Fu作用后Oh，大部分氣管上皮脫落，殘留間隔分布的裸核樣細(xì)胞(即G0期細(xì)胞)；去除5-FU后恢復(fù)3h，裸核細(xì)胞消失，細(xì)胞呈扁平狀，細(xì)胞核變長，

5、細(xì)胞漿伸展幾乎可以將基底膜覆蓋；6h，細(xì)胞核變圓，有處可見變?yōu)榱⒎缴掀?，?xì)胞數(shù)增多；12小時(shí)，上皮完全變?yōu)榱⒎缴掀?，胞核增大，胞漿增多，上皮細(xì)胞數(shù)目繼續(xù)增多；恢復(fù)至24小時(shí)，細(xì)胞表面出現(xiàn)多量纖毛；恢復(fù)48h，氣管上皮接近恢復(fù)假復(fù)層結(jié)構(gòu)。在有TSA作用情況下，去除5-Fu作用后0-12小時(shí)，基底膜上殘留裸核細(xì)胞基本沒有變化，但是數(shù)量稍有增加；24-48小時(shí)，裸核細(xì)胞消失，細(xì)胞成扁平狀，細(xì)胞核變長，細(xì)胞漿伸展覆蓋基底膜。 2、免疫組

6、化檢測結(jié)果：HDAC1呈胞核陽性。無TSA作用時(shí)經(jīng)5-Fu作用后0小時(shí)， 未見HDAC1陽性細(xì)胞；去除5-Fu后3-6小時(shí)，仍未見明顯HDAC1陽性細(xì)胞；12小時(shí)，HDAC1陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，并可見幾個(gè)HDAC1陽性細(xì)胞圍繞著底部一個(gè)HDAC1陰性細(xì)胞和多個(gè)HDAC1陽性細(xì)胞間夾著幾個(gè)HDAC1陰性細(xì)胞分布的現(xiàn)象；24小時(shí)，HDAC1陽性細(xì)胞數(shù)最多，累及全層。48小時(shí)，HDAC1陽性細(xì)胞數(shù)略減少，陽性細(xì)胞分布集中于假復(fù)層結(jié)構(gòu)頂部即靠

7、近管腔側(cè)。TSA作用后，基本沒有HDAC1陽性細(xì)胞出現(xiàn)。 3、Western blotting檢測結(jié)果：無TSA作用時(shí)，HDAC1正常無表達(dá)，去除5-FU后0小時(shí)無表達(dá)，3、6、24小時(shí)表達(dá)量依次遞增，24小時(shí)達(dá)高峰，48小時(shí)表達(dá)量略減少。TSA作用時(shí)，HDAC1表達(dá)明顯受到抑制。 結(jié)論： 1、TSA可以阻斷經(jīng)過5-Fu處理后的氣管上皮損傷修復(fù)過程，抑制氣管干細(xì)胞的分化，造成氣管干細(xì)胞的增殖堆積。 2、本