曲古抑菌素A聯(lián)合順鉑對肺腺癌A549凋亡的影響.pdf

1、表觀遺傳學是遺傳學分支學科，指在不改變DNA序列的前提下，基因或者蛋白表達發(fā)生變化，并可以在細胞的生長和傳代過程中穩(wěn)定傳遞，主要包括組蛋白的共價修飾，DNA甲基化，基因沉默，染色質(zhì)重塑，以及非編碼RNA編輯等機制。表觀遺傳學與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系，腫瘤中存在表觀遺傳方式的異常。表觀遺傳學通過影響腫瘤抑制基因及其表達，促進腫瘤發(fā)生。組蛋白組成了核小體，它可以被多種化合物所修飾，如磷酸化、乙?；图谆?，稱為共價修飾，組蛋白的這些共

2、價修飾作用主要發(fā)生在其N2末端，其中最為重要的是組蛋白乙?；?，組蛋白乙?；瘯δ[瘤細胞的染色體結(jié)構(gòu)以及基因的表達產(chǎn)生影響，從而使腫瘤的治療更加樂觀。
　　組蛋白乙酰化和去乙?；诩毎盘栟D(zhuǎn)導、分裂、凋亡、細胞內(nèi)的DNA修復、以及及染色體組裝等方面起著重要作用。各種抗腫瘤藥物有著不同的作用特點，不同類型的腫瘤使用不同的抗腫瘤藥物，其作用機制各不相同，但多種針對實體瘤或血液系統(tǒng)腫瘤的抗腫瘤藥物均可與組蛋白去乙?；敢种苿┞?lián)合，起到協(xié)同

3、作用，研究發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤藥物與組蛋白去乙?；敢种苿┞?lián)合后，比單藥使用抗腫瘤藥物組生存率高，對腫瘤細胞殺傷作用顯著，并且其療效有統(tǒng)計學差異。
　　組蛋白去乙?；敢种苿┰趷盒阅[瘤的治療作用已受到廣泛認可。組蛋白去乙?；敢种苿┠壳俺３Ｓ脕砼cDNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、激素、化療藥物如紫杉醇及鉑類等、酪氨酸激酶受體阻滯劑等藥物聯(lián)合使用。
　　目前在肺癌的研究中，組蛋白去乙?；敢种苿┞?lián)合鉑類藥物的報道較少，為研究組

4、蛋白去乙酰化酶抑制劑與順鉑聯(lián)合用藥，對肺癌細胞的影響，并對其作用機制進一步探索，設(shè)計了本次的實驗。
　　目的:研究曲古抑菌素A(trichostatinA，TSA)聯(lián)合順鉑(cisplatin)對肺腺癌細胞株A549凋亡的影響，以及藥物處理后A549細胞中cFLIP、caspase-8蛋白的表達情況。
　　方法:1、使用PRMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)肺腺癌A549細胞株，將細胞分為四組:1）、對照組2）、TSA250nmol/L

5、處理組3）、Cisplatin10μg/mL處理組4）、TSA250nmol/L+Cisplatin10μg/m L聯(lián)合處理組，藥物處理24h后，使用光學顯微鏡觀察各個組細胞形態(tài)學的變化。2、使用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法測定細胞的抑制率，將細胞分為10組:1）、空白對照組2）、TSA250nmol/L處理組3）Cisplatin5.3μg/mL處理組4）TSA250nmol/L+ Cisplatin5.3μg/mL處理組5）Cis

6、platin9μg/m處理組6）TSA250nmol/L+Cisplatin9μg/mL處理組7）Cisplatin13μg/mL處理組8）TSA250nmol/L+ Cisplatin13μg/mL處理組9）Cisplatin20μg/mL處理組10）TSA250nmol/L+ Cisplatin20μg/mL處理組。測定不同濃度順鉑處理細胞后，對細胞抑制率，以及不同濃度順鉑聯(lián)合TSA處理細胞后，對細胞的抑制率。3、按照1中的分組方法

7、將細胞分為4組，使用Hoechst33258染色法顯示不同處理組細胞凋亡的特點。4、按照1中的分組方法將細胞分為四組，使用Western blot法檢測cFLIP、Pro-caspase-8及Caspase-8蛋白表達的變化。實驗數(shù)據(jù)使用SPSS15軟件進行x2檢驗、t檢驗，p＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:1、光學顯微鏡下觀察四個組藥物處理后細胞形態(tài)的變化
　?、賹φ战M:細胞排列規(guī)則，緊密貼壁，細胞邊界清晰，未

8、看到懸浮死細胞。
　　②TSA250nmol/L處理組:細胞變大，有些細胞呈并指狀，細胞間隙增大，可見少量懸浮死細胞。
　　③Cisplatin10μg/mL處理組:細胞比對照組變小、變圓，發(fā)生皺縮，可見較多死細胞。
　?、躎SA250nmol/L+ cisplatin10μg/mL聯(lián)合處理組:與前三組相比，細胞密度明顯下降，細胞發(fā)生皺縮，可見大量死細胞懸浮。
　　2、四甲基偶氮唑鹽（MTT法）檢測不同濃度順鉑對

9、細胞的抑制作用，以及不同濃度順鉑聯(lián)合TSA對細胞的抑制作用
　　使用不同濃度的順鉑處理細胞，發(fā)現(xiàn)順鉑對細胞的抑制作用與順鉑的濃度呈正相關(guān)。隨著順鉑濃度的增加，細胞凋亡率增加。當聯(lián)合TSA后，各組對細胞的抑制率均升高。Cisplatin5.3μg/mL、TSA250nmol/L+ Cisplatin5.3μg/mL細胞抑制率分別為13.68％、26.42％。Cisplatin9μg/mL、TSA250nmol/L+ Cisplati

10、n9μg/mL細胞抑制率分別為28.73％、46.72％。Cisplatin13μg/mL、TSA250nmol/L+ Cisplatin13μg/mL細胞抑制率分別為44.58％、49.65％。Cisplatin20μg/mL、TSA250nmol/L+Cisplatin20μg/mL細胞抑制率分別為51.12％、61.92％。順鉑與TSA聯(lián)合對細胞的抑制明顯高于單藥組(p＜0.05)。
　　3、Hoechst33258染色法觀

11、察各組使用藥物處理后細胞凋亡的特點
　　各個組藥物處理24h后，使用Hoeschst33258染色法觀察細胞的凋亡特點，相比于對照組，TSA及Cisplatin藥物單藥處理組凋亡細胞增多，出現(xiàn)染色質(zhì)凝集，核染色熒光增強，聯(lián)合用藥上述現(xiàn)象更加明顯，熒光度增強，并可以觀察到核裂解及凋亡小體。
　　4、TSA聯(lián)合Cisplatin對cFLIP蛋白表達量的影響
　　使用TSA250nmol/L聯(lián)合Cisplatin10μg/m

12、L處理細胞24h后，單藥處理組cFLIP蛋白表達量減少，相比對照組及單藥處理組，聯(lián)合用藥組cFLIP蛋白表達明顯減少。測定各個處理組蛋白灰度值，結(jié)果顯示灰度值差異有統(tǒng)計學意義。
　　5、TSA聯(lián)合Cisplatin對caspase-8及其前體表達的影響
　　TSA250nmol/L聯(lián)合Cisplatin10μg/mL處理細胞24h后，單藥處理組Pro-caspase-8表達減少，caspase-8蛋白表達增多，與對照組與單藥