順鉑聯(lián)合雷帕霉素、3-MA對胰腺癌A549細(xì)胞及其裸鼠原位移植瘤的影響.pdf

1、目的:
　　1、探討順鉑分別聯(lián)合雷帕霉素、3-MA對肺腺癌A549細(xì)胞生長的抑制作用及其相關(guān)機(jī)制;
　　2、探討順鉑分別聯(lián)合雷帕霉素、3-MA對裸鼠肺腺癌A549細(xì)胞癌原位移植瘤的生長抑制作用和相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　一、對肺腺癌A549細(xì)胞的處理
　　1、將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞用0.25％胰酶消化、收獲、計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為1.0×106/ml，每孔200μl接種到96孔板中，過夜貼壁后加入雷帕霉

2、素(RAPA，rapamycin)，使其終濃度分別為0.1 nmol/L，1.0nmol/L，10.0nmol/L，100.0nmol/L，未加藥的對照組和加藥組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)板置37℃、5％ C02孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h后，每孔中加入MTT（濃度5mg/mL）20μL，置37℃、5％ CO2孵箱中繼續(xù)孵育4h，小心棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，震蕩5min，用Bio-Rad酶標(biāo)儀在測試波長為570nm，濾過波長

3、為655nm處讀取吸光度(A)值。細(xì)胞增殖抑制率=（對照組平均A值-加藥組平均A值）/對照組平均A值×100％抑制率(％)=（A對照-A實(shí)驗(yàn)）/（A對照-A空白）100％，同樣的方法用于順鉑和3MA。然后用graphpad prism5軟件計(jì)算出各藥物的50％細(xì)胞抑制濃度(50％ inhibitory concentration,IC50)，順鉑(DDP) IC50:15μmol/L，雷帕霉素IC50:10nmol/L，3-MAIC50

4、:3μmol/L，并以此作為實(shí)驗(yàn)濃度。
　　2、將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞用0.25％胰酶消化，將A549細(xì)胞分別以每孔1.0×106/ml密度接種于六孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長至孔底面積約70％-80％后分別加入稀釋好的藥物。本實(shí)驗(yàn)分為四組:對照組（無任何藥物干預(yù)的A549細(xì)胞）、順鉑組（在A549細(xì)胞中加15μmol/L的DDP）、順鉑+雷帕霉素組（加10nmol/L的RAPA1h后再加15μmol/L的DDP）、順鉑+3-MA

5、組（加3μmol/L的3-MA1h后再加15μmol/L的DDP），分別均培養(yǎng)24h、48h、72h后進(jìn)行檢測。
　　3、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測用藥后24h、48h、72h肺癌A549細(xì)胞生長遷移的情況。
　　4、Real time RT-PCR法檢測A549細(xì)胞經(jīng)不同藥物作用24h、48、72h后mTOR、LC3-Ⅱ及Bax mRNA的表達(dá)情況。
　　5、Western blot方法檢測A549細(xì)胞經(jīng)不同藥物作用48、

6、72h后mTOR、LC3-Ⅱ及Bax的蛋白表達(dá)水平。
　　二、對肺腺癌A549細(xì)胞癌原位移植瘤的處理
　　1、將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞用0.25％胰酶消化，調(diào)整成終濃度為1.0×107/ml，用1ml注射器注射到裸鼠右側(cè)腋部皮下，每只0.2ml，共接種24只，飼養(yǎng)約15d（此時(shí)裸鼠腫瘤大小達(dá)到1cm3左右），將建立好的裸鼠肺腺癌A549細(xì)胞原位移植瘤模型隨機(jī)分為4組，每組6只，即對照組（生理鹽水組）、順鉑組(2mg/k

7、g)、順鉑(2mg/kg)+雷帕霉素(1mg/kg)、順鉑(2mg/kg)+3-MA組(2mg/kg)，腹腔注射給藥15天，每只裸鼠注射計(jì)量為0.2ml/天，對照組和順鉑組每天注射一次，聯(lián)合用藥組為隔天注射一次。用藥期間記錄裸鼠飲食和精神狀態(tài)變化，測量裸鼠體重和腫瘤大小，用藥結(jié)束后處死全部裸鼠，完整剝除瘤體，測量腫瘤大小、計(jì)算腫瘤抑制率、HE染色觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　2、Real time RT-PCR法檢測A549細(xì)胞裸

8、鼠原位移植瘤模型經(jīng)藥物作用后mTOR、LC3-Ⅱ及Bax mRNA的表達(dá)情況。
　　3、Western blot方法及免疫組織化學(xué)方法檢測A549細(xì)胞裸鼠原位移植瘤模型經(jīng)藥物作用后瘤體中mTOR、LC3-Ⅱ及Bax的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　一、不同藥物對肺腺癌A549細(xì)胞的作用
　　1、順鉑、雷帕霉素、3-MA單獨(dú)作用于A549細(xì)胞時(shí)，均表現(xiàn)為抑制癌細(xì)胞生長的作用，且呈時(shí)間和濃度依賴性，作用時(shí)間越長，藥物

9、濃度越大，對細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)。
　　2、比較四個(gè)分組中藥物對A549細(xì)胞的抑制作用:24h時(shí)間點(diǎn)，順鉑聯(lián)合雷帕霉素對肺癌A549細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng);而48h和72h時(shí)間點(diǎn)，順鉑聯(lián)合3-MA對A549細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。
　　3、不同藥物對A549細(xì)胞殺傷性的病理學(xué)形態(tài)觀察
　　倒置顯微鏡下觀察A549細(xì)胞經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)組（對照組、順鉑組、順鉑+雷帕霉素組、順鉑+3-MA組）處理后細(xì)胞的形態(tài)變化。培養(yǎng)24h時(shí)細(xì)胞數(shù)目略有減

10、少，順鉑組、順鉑+3-MA組、順鉑+雷帕霉素組對A549細(xì)胞的殺傷作用依次增強(qiáng)。表現(xiàn)為A549細(xì)胞體積變小、變圓并皺縮，折光性差，排列疏松，核漿比變大，貼壁能力減弱，有些細(xì)胞胞漿內(nèi)可見較多顆粒，并出現(xiàn)飄浮的細(xì)胞;培養(yǎng)48h后細(xì)胞數(shù)目繼續(xù)減少，胞漿內(nèi)顆粒增多，且可見細(xì)胞碎片，貼壁細(xì)胞的數(shù)量較對照組明顯減少。順鉑組、順鉑+雷帕霉素組、順鉑+3-MA組對A549細(xì)胞的殺傷作用依次增強(qiáng)。對照組肺癌細(xì)胞仍貼壁生長，狀況良好。培養(yǎng)72h后細(xì)胞數(shù)目大

11、量減少，可見明顯的細(xì)胞碎片，貼壁細(xì)胞的數(shù)量較對照組顯著減少。對照組肺癌細(xì)胞生長擁擠，狀況欠佳。
　　4、Real time RT-PCR結(jié)果顯示
　　(1)24h時(shí)各組（對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組）mTORmRNA的2-△△CT值為1.000±1.000，0.667±0.013，0.418±0.007，0.684±0.024，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05

12、);DDP+RAPA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。24h時(shí)各組(對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組)LC3-Ⅱ mRNA的2-△△CT值為1.000±1.000，1.489±0.031，1.686±0.069，1.376±0.033，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05

13、）。24h時(shí)各組(對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組)Bax mRNA的2-△△CT值為1.000±1.000，1.915±0.041，1.467±0.062，1.324±0.060，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　(2)48h時(shí)各組（對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組）mTORmRNA的2-△△CT值為1.000±1.000，1.796±

14、0.003，0.732±0.007，0.645±0.008，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。48h時(shí)各組(對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組)LC3-Ⅱ mRNA的2-△△CT值為1.000±1.000，1.325±0.007，1.803±0.083，1.253±0.072，各用藥組與對照組相比

15、，表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。48h時(shí)各組(對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組)Bax mRNA的2-△△CT值為1.000±1.000，1.346±0.080，1.133±1.125，1.864±0.104，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+3-MA組與DDP組相

16、比，表達(dá)量顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3)72h時(shí)各組（對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組）mTORmRNA的2-△△CT值為1.000±1.000，0.749±0.030，0.636±0.034，0.583±0.008，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。72h時(shí)各組(對

17、照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組)LC3-ⅡmRNA的2-△△CT值為1.000±1.000，1.428±0.080，1.836±0.056，1.153±0.011，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。72h時(shí)各組(對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組)Bax mRNA的2-△△

18、CT值為1.000±1.000，1.462±0.029，1.117±0.070，1.935±0.068，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5、Western blot結(jié)果顯示
　　(1)48h各組（對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組）mTOR的相對表達(dá)量分別為1.096±0.03

19、6，0.608±0.018，0.454±0.051，0.447±0.011，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。48h各組（對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組）LC3-Ⅱ的相對表達(dá)量分別為0.228±0.018，0.426±0.010，0.556±0.010，0.355±0.009，各用藥組與對照組

20、相比，表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。48h各組（對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組）Bax的相對表達(dá)量分別為0.253±0.006，0.463±0.011，0.392±0.006，0.897±0.022，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比，表達(dá)

21、量顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　(2)72h時(shí)各組(對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組)mTOR的相對表達(dá)量分別為1.132±0.007，0.573±0.025，0.402±0.009，0.364±0.009，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。72h時(shí)各組（對照組，DDP組，

22、DDP+RAPA組，DDP+3-MA組）LC3-Ⅱ的相對表達(dá)量分別為0.239±0.008，0.492±0.009，0.571±0.009，0.278±0.009，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。72h時(shí)各組(對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組)Bax的相對表達(dá)量分別為0.248±0.006，0

23、.581±0.007，0.287±0.009，0.916±0.005，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　二、不同藥物對肺腺癌A549細(xì)胞裸鼠原位移植瘤的作用
　　1、24只裸鼠均成瘤，成瘤率為100％。用藥期間各組（對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組）裸鼠飲食及精神狀態(tài)未見明顯異

24、常;用藥前各組裸鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(17.4±2.1g，18.6±2.7g，18.9±1.9g，17.8±2.1g，P＞0.05)，用藥后第一天測量各組裸鼠體重，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(29.1±1.2g，29.4±0.9g，29.7±1.3g，18.9±2.6g，P＞0.05)。藥物治療期間各組（對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組）裸鼠腫瘤體積的腫瘤大小分別為1.110±0.035，0.705±0.033，0.62

25、3±0.042，0.500，腫瘤的抑制率分別為0％，36.5％，43.9％，55.0％，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2、各組裸鼠原位移植瘤形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果:顯微鏡下觀察HE染色切片，裸鼠原位移植瘤的瘤組織呈低分化肺腺癌，癌細(xì)胞異形性明顯，核大深染，細(xì)胞形態(tài)多樣，核染色質(zhì)呈粗顆粒狀。
　　3、Real time RT-PCR結(jié)果顯示:(1)各組(對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組

26、)mTOR mRNA的2-△△CT為1.000±1.000，0.753±0.007，0.635±0.008，0.593±0.012，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(2)各組(對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組)LC3-Ⅱ mRNA的2-△△CT為1.000±1.000，1.316±0.006、

27、1.733±0.007，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(3)各組（對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組）Bax mRNA的2-△△CT為1.000±1.000,1.323±0.008,0.1.178±0.010,1.756±0.024，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

28、＜0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、Western blot結(jié)果顯示:(1)各組（對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組）mTOR的相對表達(dá)量分別為1.290±0.028，0.694±0.017，0.522±0.002，0.485±0.004，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+3-MA組與DDP組相

29、比，表達(dá)量顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(2)各組（對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組）LC3-Ⅱ的相對表達(dá)量分別為0.330±0.008，0.581±0.008，0.685±0.008，0.383±0.005，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。(3)各組（對照組，DDP組，DDP+RA

30、PA組，DDP+3-MA組）Bax的相對表達(dá)量分別為0.258±0.006，0.594±0.008，0.296±0.008，0.919±0.020，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;DDP+3-MA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5、免疫組織化學(xué)結(jié)果:各組（對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組）mTOR免疫反應(yīng)積分中位數(shù)為8，6，5，

31、4，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組（對照組，DDP組，DDP+RAPA組，DDP+3-MA組）LC3-Ⅱ免疫反應(yīng)積分中位數(shù)為2，4，6，3，各用藥組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組（對照組，DDP組，DDP

32、+RAPA組，DDP+3-MA組） Bax的免疫反應(yīng)反應(yīng)積分中位數(shù)為2，5，3，7，各用藥組與對照組相比，表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比，表達(dá)量顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　一、不同藥物對肺腺癌A549細(xì)胞的作用
　　1、順鉑聯(lián)合雷帕霉素、順鉑聯(lián)合3-MA均可以對A549細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制作用，且該作用大于單獨(dú)使用順鉑對癌細(xì)胞造成的抑制作用

33、。
　　2、順鉑聯(lián)合雷帕霉素與順鉑聯(lián)合3-MA相比，24h時(shí)前者的對肺癌A549細(xì)胞的抑制作用大于后者，而48h和72h時(shí)結(jié)果相反。
　　3、順鉑+雷帕霉素組在24h時(shí)間點(diǎn)LC3-Ⅱ表達(dá)顯著高于其它組，而在48h和72h順鉑+3-MA組Bax表達(dá)顯著升高。提示早期順鉑+雷帕霉素組可能因自噬占據(jù)細(xì)胞死亡的主導(dǎo)地位，而后期（順鉑+3-MA組）可能因抑制自噬反而激活凋亡，使癌細(xì)胞大量死亡。
　　二、不同藥物對肺腺癌A549細(xì)