自噬抑制劑3-MA增強順鉑對神經母細胞瘤化療效果及其分子機制的研究.pdf

1、目的：研究通過抑制自噬，增強常規(guī)化療藥物順鉑對神經母細胞瘤SH-SY5Y治療效果的可能性，并探究其可能的分子機制。
　　方法：
　　1.將人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞株進行體外培養(yǎng)，采用不同濃度（0、1.25、2.5、5、10、20、40ug/ml）的順鉑分別處理處于對數(shù)生長期的神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞24h、48h、72h，及不同濃度（0、1.25、2.5、5、10mM）的3-MA分別處理處于對數(shù)生長期的神經母細

2、胞瘤SH-SY5Y細胞24h后，應用MTS比色法測定細胞的存活率，采用不同濃度（0、2.5、5、10、20ug/ml）的順鉑及聯(lián)合應用自噬抑制劑3-MA（5mM）處理處于對數(shù)生長期的神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞24h后，應用MTS比色法測定細胞的存活率，并分別計算單獨應用順鉑及順鉑聯(lián)合自噬抑制劑后順鉑的IC50值。
　　2.于普通光學顯微鏡下觀察對照組、常規(guī)化療藥物順鉑（10ug/ml）組、自噬抑制劑3-MA（5mM）組、自噬抑

3、制劑3-MA（5mM）聯(lián)合常規(guī)化療藥物順鉑（10ug/ml）組細胞形態(tài)學上的改變。
　　3.用同樣的方法處理細胞后，將四組處理后的細胞進行PI染色，在熒光顯微鏡下觀察晚期凋亡及壞死細胞。
　　4.應用western blot方法分別檢測上述四組細胞的自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ及凋亡相關蛋白Caspase-3的表達變化情況。
　　實驗數(shù)據(jù)應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料均進行正態(tài)性及

4、方差齊性檢驗，經檢驗后符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差(-x±S)表示，不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）（M(P25～P75)）表示。經檢驗符合正態(tài)分布且方差齊的多組均數(shù)的比較應用單因素方差分析（One-way ANOVA），多組間的兩兩比較采用SNK法（Student-Newman-Keuls）；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)多組比較采用Kruskal-wallis H檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗。以α

5、=0.05為檢驗標準，以P＜0.05作為差別顯著性判斷標準。
　　結果：
　　1.經順鉑處理人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞24小時后，對細胞活力影響較小，僅在順鉑濃度到達10ug/ml時，細胞存活率有所下降（P<0.05）。順鉑作用48小時后，當順鉑濃度到達5ug/ml時，細胞活力下降（P<0.01），當順鉑濃度到達10ug/ml時，細胞活力下降顯著（P<0.001）。順鉑作用72小時后，除濃度為1.25ug/ml組，其余

6、各組細胞活力均下降顯著，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。不同濃度的自噬抑制劑3-MA單獨作用于神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞24h后，對細胞活力無明顯影響，即使3-MA在最大濃度10mmol/L時，細胞存活率與空白對照組仍無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。單獨應用順鉑及聯(lián)合自噬抑制劑3-MA后順鉑的IC50值分別為10.9ug/ml和5.25ug/ml，聯(lián)合自噬抑制劑后順鉑的IC50值降低了49％。
　　2.于光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)

7、學的改變，發(fā)現(xiàn)對照組細胞數(shù)目較多，均貼壁生長，細胞形態(tài)較一致，呈長梭形或多角形，體積較小，有聚集成團傾向，細胞代謝產物較少；自噬抑制劑處理組細胞數(shù)量無明顯減少，但細胞凸起不明顯，少量呈現(xiàn)橢圓形，順鉑處理組細胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)發(fā)生較明顯變化，看不到長梭形狀的細胞，胞質皺縮，多呈圓形或短橢圓形，聚集成團，自噬抑制劑聯(lián)合順鉑組細胞數(shù)量減少更明顯，且細胞分散，看不到明顯成團細胞，培養(yǎng)皿內可見大量細胞產物及死亡細胞。
　　3.熒光顯微鏡下

8、觀察細胞的晚期凋亡及壞死情況發(fā)現(xiàn)，對照組細胞生長良好，未見晚期凋亡及壞死細胞，3-MA處理組晚期凋亡及壞死細胞較對照組無明顯增多，順鉑處理組較對照組及3-MA處理組晚期凋亡及壞死細胞明顯增多，順鉑聯(lián)合3-MA處理組細胞的晚期凋亡及壞死率又明顯高于單用順鉑組。
　　4.Western blot檢測結果顯示：對照組自噬及凋亡相關蛋白均處于基礎水平，應用3-MA抑制自噬后，檢測到自噬相關蛋白表達下降，但凋亡相關蛋白Caspase-3表達

9、并未見明顯增高；順鉑處理神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞24h后，與對照組相比自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ及凋亡相關蛋白Caspase-3的表達均升高，加入自噬抑制劑后，自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達較單獨應用順鉑組明顯下降，但凋亡相關蛋白Caspase-3的表達較單獨應用順鉑組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結論：
　　1.順鉑能夠在體外抑制神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞

10、的增值，且在一定的濃度范圍內這種抑制作用具有時間、劑量依賴性；
　　2.單獨應用自噬抑制劑3-MA24小時，在一定的濃度范圍內無明顯抑制增值作用，即單獨抑制自噬并不能有效抑制神經母細胞瘤的增殖；
　　3.順鉑聯(lián)合自噬抑制劑3-MA后，可降低順鉑的IC50值，起化療增敏作用；
　　4.順鉑誘導神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞發(fā)生凋亡的同時，自噬作用增強，且自噬在細胞凋亡過程中起保護作用；
　　5.抑制自噬可以加強順鉑