mTOR通路抑制劑依維莫司對膠質(zhì)瘤自噬作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　 腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為好發(fā)的、惡性程度很高的腫瘤，目前臨床給予手術(shù)加放療、化療的綜合治療方案后，高級別的膠質(zhì)瘤患者其中位生存期僅能達到16.7個月，其在很大程度上是由于復(fù)發(fā)并形成轉(zhuǎn)移灶所致。傳統(tǒng)的化療藥物是通過促進細(xì)胞的凋亡，達到抑制腫瘤的生長，但耐藥性出現(xiàn)較快。為了逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象，我們急需尋找新的細(xì)胞蛋白靶點，改進目前的化療方案，延長患者的生存期。細(xì)胞死亡目前認(rèn)為包括3種類型：壞死、凋亡和自噬性細(xì)胞死亡。在

2、腫瘤細(xì)胞中，凋亡蛋白都有不同程度的缺陷（限制藥物對凋亡通路的激活），自噬（現(xiàn)在被認(rèn)為是Ⅱ型細(xì)胞死亡，有別于細(xì)胞凋亡）是指細(xì)胞通過單層或雙層膜包裹待降解物形成自噬體，然后形成自噬溶酶體并進行消化及降解，其作為一種細(xì)胞的保護機制，其蛋白往往是被優(yōu)先保留的。mTOR信號通路是細(xì)胞生長、增殖及細(xì)胞周期的中心調(diào)控器，其也是PI3K/AKT信號通路（調(diào)控細(xì)胞自噬）的中心環(huán)節(jié)。依維莫司作為mTOR信號通路特異性的阻斷劑，近年來發(fā)現(xiàn)其對肝癌、胰腺癌等腫

3、瘤有明顯的抗癌作用。但是目前關(guān)于mTOR通路及其抑制劑對膠質(zhì)瘤的研究較少，有以下不足之處：①mTOR相關(guān)通路蛋白在人腦膠質(zhì)瘤的表達及其機制仍未完全明確；②mTOR抑制劑對不同遺傳背景膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中對凋亡和自噬的影響及其之間的關(guān)系仍不明確；③mTOR抑制劑誘導(dǎo)對膠質(zhì)瘤裸鼠皮下移植瘤的療效仍不明確。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，試圖通過體外培養(yǎng)來自不同遺傳背景的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87MG、U251、SHG44，給予不同濃度的依維莫司，來檢測膠質(zhì)瘤

4、細(xì)胞株給藥前后細(xì)胞生長、細(xì)胞周期變化及細(xì)胞的自噬；并通過建立三種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤模型，給與依維莫司腹腔注射，采用免疫組化、細(xì)胞周期、腫瘤血管密度等方法進行測定，來檢測依維莫司對不同細(xì)胞株抑制情況。試圖證明mTOR信號通路能夠作為膠質(zhì)瘤治療的一個新的靶點，為腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的實驗依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 探討依維莫司作用于人U87-MG、U251-MG、SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體內(nèi)外作用及其可能的機制。

5、
　　 1.培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251、SHG44，并用不同濃度的藥物干預(yù)細(xì)胞的生長，明確其凋亡和自噬情況。
　　 2.建立膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251、SHG44裸鼠移植瘤模型，并用不同濃度的藥物干預(yù)移植瘤的生長，明確依維莫司對不同細(xì)胞株抑制情況及其機制。
　　 研究方法：
　　 1.免疫組織化學(xué)染色檢測32例人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達情況，并用WesternBlot法檢測人腦膠

6、質(zhì)瘤標(biāo)本的mTOR蛋白的表達情況。
　　 2.培養(yǎng)穩(wěn)定生長的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251、SHG44，采用MTT法觀察不同劑量mTOR抑制劑依維莫司對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制作用；細(xì)胞凋亡熒光Hoechst33342/PI雙染發(fā)測定細(xì)胞細(xì)胞凋亡；單丹磺酰尸胺(MDC)熒光染色檢測自噬囊泡；流式細(xì)胞法定量觀察細(xì)胞周期；Westernblot法進一步分析驗證依維莫司對膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用的通路及其機理。
　　 3.通過建立膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U

7、87、U251、SHG44裸鼠皮下移植瘤模型，并給與依維莫司腹腔注射，采用免疫組化、細(xì)胞周期及凋亡、腫瘤血管密度等方法進行測定，了解依維莫司對不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞株移植瘤的抑制作用，并探討其可能引起的機制。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.mTOR蛋白在Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤較Ⅰ、Ⅱ級膠質(zhì)瘤的表達有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，Ⅰ級膠質(zhì)瘤與對照組表達無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2.體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中，不同細(xì)胞株受抑制

8、程度均隨著依維莫司濃度的增加而增加。其中U87-MG細(xì)胞株是最敏感的；U251細(xì)胞株有中度敏感性；SHG-44細(xì)胞株是最不敏感的。
　　 3.細(xì)胞凋亡熒光Hoechst33342/PI雙染結(jié)果顯示各株膠質(zhì)瘤細(xì)胞均發(fā)生了一種不同于凋亡的死亡方式，可能為細(xì)胞自噬。行MDC活細(xì)胞染色顯示，依維莫司作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞增加了酸性囊泡樣細(xì)胞器（自噬泡）的形成，可認(rèn)為依維莫司可促進膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的形成。三種細(xì)胞株均給與IC50劑量的依維莫司，在

9、48小時后進行流式細(xì)胞周期分析。我們發(fā)現(xiàn)三種細(xì)胞株均有特異性的G0/G1期細(xì)胞阻滯。用AnnexinV檢測沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。
　　 4.用Westernblot分析依維莫司作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞株后對mTOR，p70S6K,4E-BP-1和p70S6K的非磷酸化和磷酸化水平的影響。在所有三個細(xì)胞株中，隨著依維莫司劑量的增加，mTOR、p70S6K、4E-BP-1的磷酸化表達水平均明顯減少，非磷酸化的p70S6K并沒有發(fā)現(xiàn)具有明顯

10、的變化，只有4E-BP-1的非磷酸化表達水平亦隨依維莫司濃度的升高而有所減少。
　　 5.建立膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251、SHG44裸鼠皮下移植瘤模型，繪制移植瘤生長曲線。在第12天末開始給與裸鼠依維莫司后發(fā)現(xiàn)，各細(xì)胞株實驗組裸鼠移植瘤體積較對照組明顯減小，并通過公式測量不同細(xì)胞株的抑瘤率，U-87MG，SHG-44，U251細(xì)胞株的抑瘤率分別為30.6％,42.1％，29.7％，依維莫司對膠質(zhì)瘤有明顯的抑制作用。
　　

11、 6.對不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞株行細(xì)胞凋亡測定，各細(xì)胞株中實驗組較對照組的凋亡并沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。行細(xì)胞周期測量，各細(xì)胞株中實驗組較對照組均有明顯的G0/G1期停滯(P＜0.05)。其中U-87MG細(xì)胞株的G0/G1期停滯較對照組差異最大，SHG-44次之，U251最小。
　　 7.行腫瘤血管密度測定，細(xì)胞株U-87MG、U-251中實驗組腫瘤血管密度值較對照組沒有明顯差異(P＞0.05)，細(xì)胞株SHG-44實驗組

12、腫瘤血管MVD值為31.1(25.0-37.2)，較對照組20.9(14.8-27.0)有明顯差異(P＜0.05)。進一步測量不同細(xì)胞株VEGF的表達水平，在SHG-44細(xì)胞株實驗組的VEGF表達水平較對照組明顯下調(diào)，其余兩種細(xì)胞株間沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。
　　 8.分離腫瘤組織后，免疫組化分析各標(biāo)本，其中U251細(xì)胞株實驗組較對照組的pmTOR表達增加，p70S6K1、pAKT表達減少，VEGF表達沒有明顯差異；U-87MG細(xì)胞株

13、實驗組較對照組的表達p70S6K1表達減少，pAKT、pmTOR、VEGF表達均沒有明顯差異；SHG-44細(xì)胞株實驗組較對照組的pmTOR、p70S6K1表達均沒有明顯差異、pAKT表達減少，VEGF表達明顯減少。
　　 結(jié)論：
　　 1.mTOR抑制劑依維莫司通過阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬，并抑制腫瘤血管的生成，從而發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤的作用。
　　 2.mTOR信號通路能夠作為治療膠質(zhì)瘤的一個新靶點，為腦膠質(zhì)