兒童腎母細(xì)胞瘤中自噬抑制及其意義探討.pdf

1、目的：
　　腎母細(xì)胞瘤又稱腎胚胎瘤或Wilm氏瘤，是最常見的腹部惡性腫瘤，其發(fā)病率在小兒腹部腫瘤中占首位，占兒科惡性腫瘤的6％。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腎母細(xì)胞瘤中存在Bcl-2表達(dá)升高，p53變異，以及β-catenin激活，已知這幾種分子均可通過調(diào)控自噬參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，故推測(cè)腎母細(xì)胞瘤存在自噬失調(diào)。細(xì)胞自噬是一種主要由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)內(nèi)容物自我降解的過程，是細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種保護(hù)性機(jī)制，但過度自噬對(duì)細(xì)胞有殺傷作用，已經(jīng)被

2、納入為一種腫瘤的特征性活動(dòng)。目前尚無關(guān)于自噬和腎母細(xì)胞瘤關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。本研究探究腎母細(xì)胞瘤中自噬的特征性變化，自噬調(diào)控如何影響腎母細(xì)胞瘤增殖，意在進(jìn)一步闡釋腎母細(xì)胞瘤發(fā)病機(jī)理，并探索是否可以通過調(diào)控自噬水平，提出比傳統(tǒng)治療方案更高效低毒的抑瘤方案。
　　材料和方法：
　　本研究采用細(xì)胞系G401（ATCC購進(jìn)），組織標(biāo)本采集:所有標(biāo)本來自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院組織標(biāo)本庫。所涉及的自噬調(diào)控藥物以及化療藥物3-MA、CQ、

3、Rapamycin、VCR來自Sigma, Cayman等試劑公司，。所用特異性抗體以及HRP標(biāo)記二抗:p62，Beclin1，LC3來自MBL，Sigma，Santa Crus，Invitrogen等試劑公司。
　　1.了解腎母細(xì)胞瘤中的自噬水平。組織層面:RT-PCR法檢測(cè)化療后腎母細(xì)胞瘤組織以及癌旁相對(duì)正常腎組織中自噬相關(guān)基因LC3，BECLIN1，P62和ATG5mRNA水平的表達(dá);應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)化療前后，腎母細(xì)胞瘤

4、組織以及癌旁相對(duì)正常腎組織LC3、Beclin1，p62蛋白水平的變化，以及耐藥腫瘤組織中上述三種蛋白的表達(dá);Western-blotting檢測(cè)化療后腎母細(xì)胞瘤組織以及癌旁相對(duì)正常腎組織中自噬蛋白p62，Beclin1，LC3的水平。
　　2.明確自噬調(diào)控能否協(xié)同常規(guī)化療藥(VCR)殺傷腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞。選取腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401，使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。明確單用各自噬調(diào)控藥物（CQ/3-MA/rapamycin）以及單用化療藥

5、物對(duì)G401的生長抑制，比較聯(lián)用自噬調(diào)控藥物后常規(guī)化療藥對(duì)目的細(xì)胞殺傷效用的影響（與化療藥拮抗或者協(xié)同或疊加）。
　　3.分析自噬調(diào)控藥物（CQ/3-MA/rapamycin）以及化療藥(VCR)如何影響G401細(xì)胞自噬。選取合理的藥物劑量，處理細(xì)胞24小時(shí)，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Western-blotting檢測(cè)自噬蛋白p62，LC3水平，分析有效調(diào)控劑量。
　　4.進(jìn)一步驗(yàn)證自噬抑制是否影響腫瘤生長

6、，以及藥物作用是否通過自噬。應(yīng)用慢病毒(帶有GFP-SiRNA-ATG7)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染G401，有效下調(diào)ATG7后，用不同濃度的自噬誘導(dǎo)藥物rapamycin，比較ATG7表達(dá)抑制組與對(duì)照組中rapamycin對(duì)細(xì)胞生長的抑制程度。
　　結(jié)果：
　　1.組織層面:Q-PCR結(jié)果顯示，相較于癌旁組織，癌組織:BECLIN1/P62/ATG5/ LC3基因mRNA水平表達(dá)均增高（△CT根據(jù)三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果用mean±SE法表示，通過T檢

7、驗(yàn)分析，P＜0.05視為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著性）。Western-blotting結(jié)果顯示，相較于癌旁相對(duì)正常組織，治療后癌組織Beclin1蛋白無明顯改變，p62堆積，LC3Ⅰ和LC3Ⅱ增多。免疫組化半定量結(jié)果顯示:治療前的癌組織較正常組織Beclin1，p62，LC3蛋白表達(dá)均低，其中Beclin1顯著。治療后（化療）癌組織Beclin1，p62，LC3水平均回升，且化療耐藥癌組織Beclin1，p62，LC3亦呈高水平。
　　

8、2.細(xì)胞層面:1.VCR20 nM能產(chǎn)生對(duì)G401細(xì)胞50％左右的抑制率，而繼續(xù)增加VCR濃度不能顯著提高細(xì)胞抑制率。2.自噬抑制藥物(3-MA/CQ)對(duì)G401有殺傷作用，小劑量有效;自噬激動(dòng)劑rapamycin對(duì)G401亦有殺傷作用但抑制率不高，最大抑制率約為20％。3.VCR（20 nM）聯(lián)用自噬抑制藥物(3-MA/CQ)以后，對(duì)G401的殺傷作用并無協(xié)同殺傷作用，甚至拮抗;而聯(lián)用自噬誘導(dǎo)藥物rapamycin后，對(duì)G401的殺傷

9、明顯提升，低劑量時(shí)聯(lián)用協(xié)同作用最強(qiáng)。4.Western-blotting結(jié)果顯示，在G401中，3-MA有效抑制自噬（上游）劑量為0.5mM; CQ有效抑制自噬（下游）劑量為10μM; Rapamycin有效促進(jìn)自噬（上游）劑量為1μM;0-50 nM VCR對(duì)自噬并無明顯調(diào)控作用。
　　3.自噬相關(guān)基因干擾:慢病毒（轉(zhuǎn)染所需）本身對(duì)G401細(xì)胞生長有一定抑制作用。在此基礎(chǔ)上，在下調(diào)ATG7以后，細(xì)胞生長進(jìn)一步受到抑制，而rapa

10、mycin對(duì)ATG7敲減的G401的生長抑制比對(duì)照組明顯減弱。
　　結(jié)論：
　　1.未化療兒童腎母細(xì)胞瘤普遍存在自噬抑制，化療有激活自噬的作用，但對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用或保護(hù)作用未知。自噬激活可能參與化療抵抗。
　　2.自噬抑制（CQ/3-MA與siRNA ATG7）可顯著殺傷腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401，自噬誘導(dǎo)（Rapamycin）對(duì)G401也有一定殺傷作用。
　　3.自噬抑制藥物(CQ/3-MA)聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥V