蜀葵小孢子母細(xì)胞中自噬活動(dòng)的研究.pdf

1、自噬（Autophagy，AP）是真核生物將細(xì)胞內(nèi)冗余或受損傷的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器用雙層膜包裹運(yùn)往液泡或溶酶體中降解再利用的過程，在生物體正常發(fā)育、衰老或遭受生物、非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。關(guān)于自噬的研究早期主要集中在酵母和哺乳動(dòng)物，近些年來在植物中的研究逐漸增多，但主要局限于在生物和非生物脅迫條件下的細(xì)胞的自噬，另外還局限于植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過程，對(duì)正常生長(zhǎng)發(fā)育過程中，尤其是植物的生殖過程中的自噬還鮮有研究。之前本實(shí)驗(yàn)室在透射電鏡下觀察發(fā)

2、現(xiàn)蜀葵和油菜減數(shù)分裂期小孢子母細(xì)胞內(nèi)存在復(fù)雜的類自噬體結(jié)構(gòu)，但它們是否代表真正的自噬體以及它們的形成機(jī)制和功能還不清楚。為此，本研究以蜀葵為材料，通過自噬特異性染色劑MDC染色、自噬抑制劑3-MA和E-64預(yù)處理以及亞顯微結(jié)構(gòu)觀察，對(duì)蜀葵小孢子母細(xì)胞（MMCs）中的自噬現(xiàn)象做了進(jìn)一步定性的研究。主要結(jié)果如下：
　?。?）MDC染色后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常生長(zhǎng)條件下的早期和減數(shù)分裂期MMCs細(xì)胞質(zhì)呈綠色或藍(lán)色熒光，其內(nèi)分布有數(shù)量不

3、等的藍(lán)色亮點(diǎn)，這些亮點(diǎn)即代表自噬體，這些亮點(diǎn)主要分布在細(xì)胞邊緣，有些亮點(diǎn)在細(xì)胞邊緣聚集成大的亮斑。減數(shù)分裂期MMCs內(nèi)亮點(diǎn)的數(shù)目明顯多于早期MMCs。小孢子時(shí)期亮點(diǎn)消失。
　　（2）3-MA預(yù)處理24h和36h之后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)呈綠色熒光，但自噬體數(shù)目比正常組細(xì)胞（不經(jīng)任何處理的細(xì)胞）稍有增多，但與DMSO對(duì)照組相比顯著減少。DMSO對(duì)照組與正常組細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)目顯著增多。
　?。?）E-64預(yù)處理24

4、h和36h之后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞呈藍(lán)色或綠色熒光，細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)目比正常組細(xì)胞和DMSO對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)的自噬體數(shù)目顯著增多。DMSO對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)目與正常組細(xì)胞相比也明顯增多。
　　（4）普通熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常條件下的小孢子體積較小，大小均一。3-MA預(yù)處理后，大部分（70％）小孢子體積相對(duì)變大，大小變得不均勻；相反，E-64預(yù)處理后，大部分（80%）小孢子體積變小，大小也變得不均一。
　　（5）RT-PCR

5、檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)基因ATG8在蜀葵根、莖、葉、小孢子母細(xì)胞、四分體、小孢子中都有表達(dá)。
　?。?）亞顯微結(jié)構(gòu)觀察顯示，早期蜀葵MMCs內(nèi)的確有典型的自噬體結(jié)構(gòu)存在。其形成過程有：細(xì)胞內(nèi)先出現(xiàn)新月狀雙層膜結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的膜繼續(xù)延伸形成杯狀，最后膜兩端融合形成自噬體結(jié)構(gòu)，并將一些受損細(xì)胞器及蛋白包裹在內(nèi)。隨著細(xì)胞的發(fā)育，部分自噬體被周圍另外的膜包裹形成多層膜結(jié)構(gòu)；部分自噬體內(nèi)膜斷裂并卷曲，形成胞內(nèi)體。最后，部分自噬體與質(zhì)膜融合，將內(nèi)