水痘-帶狀皰疹病毒誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的自噬作用觀察.pdf

1、水痘—帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)屬α皰疹病毒亞科，首次感染人體后能引起水痘或呈隱性感染狀態(tài)，在對人體的初次感染后，病毒沿感覺神經(jīng)侵入脊神經(jīng)節(jié)或腦神經(jīng)感覺神經(jīng)節(jié)內(nèi)并潛伏于其中。當(dāng)機(jī)體免疫力低下時病毒被再激活而引起帶狀皰疹。VZV具有親神經(jīng)性，可引起帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛(postherpetic neuralgia，PHN)，PHN在臨床上十分棘手，給患者的心理和生理帶來嚴(yán)重影響。自噬是一種高度保守的

2、細(xì)胞內(nèi)降解途徑，其依賴溶酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和錯誤折疊的蛋白質(zhì)以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。自噬也參與到固有免疫和先天性免疫清除入侵病原體的應(yīng)答過程中。近年來研究表明細(xì)胞可以激活自噬來控制人類皰疹病毒感染。然而人類皰疹病毒進(jìn)化出多種機(jī)制來逃避、抑制、破壞甚至利用細(xì)胞自噬。本文觀察了VZV在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SHSY5Y)中培養(yǎng)及增殖的特點(diǎn)和VZV感染SHSY5Y細(xì)胞后的生物學(xué)效應(yīng)，探討感染后自噬發(fā)生的規(guī)律，為有效地干預(yù)和治療VZV感染

3、提供新思路。
　　目的:
　　本研究的目的是探討VZV在SHSY5Y細(xì)胞中培養(yǎng)及增殖的特點(diǎn)，觀察VZV感染SHSY5Y細(xì)胞后的生物學(xué)效應(yīng)，探討感染后自噬發(fā)生的規(guī)律和特點(diǎn)，為有效地干預(yù)和治療VZV感染提供新思路。
　　方法:
　　1.于普通倒置顯微鏡和電子顯微鏡下觀察被感染細(xì)胞的形態(tài)變化，利用CCK-8法檢測VZV感染對細(xì)胞增殖的影響;比較不同感染復(fù)數(shù)(MOI)和不同濃度胎牛血清(FBS)維持液對病毒增殖的影響;<

4、br>　　2.利用單丹（磺）酰戊二胺(MDC)染色法檢測自噬體的形成，通過流式細(xì)胞術(shù)測定VZV感染細(xì)胞后不同時間點(diǎn)(24h、48h、72h、96h)自噬相關(guān)蛋白微管結(jié)合蛋白-1輕鏈-3B(microtubule-associated protein1 light chain3B，MAP1LC3B，又稱為LC3B)和SQSTM1/p62的表達(dá)情況;
　　3.提取VZV病毒中的DNA，利用熒光定量PCR檢測VZV感染細(xì)胞后不同時間點(diǎn)(

5、24h、48h、72h、96h)的病毒DNA拷貝數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1.普通倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，從24至96h，細(xì)胞病變數(shù)量增加和病變程度加重。電鏡觀察顯示:感染48h后核染色質(zhì)固縮、濃染，線粒體肥大及增生，胞質(zhì)空泡化和自噬小體形成，可見包裝成熟的病毒顆粒。CCK-8法提示VZV感染24h后細(xì)胞增殖被抑制，各實(shí)驗(yàn)組存活率與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。在2

6、％胎牛血清的維持液中用MOI為1的VZV感染SHSY5Y細(xì)胞，能收獲較高滴度的病毒。
　　2.MDC染色法顯示VZV感染細(xì)胞后自噬體數(shù)量增加，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明VZV感染組的自噬相關(guān)蛋白LC3B-II蛋白的表達(dá)增加，而p62蛋白的表達(dá)出現(xiàn)下降，與正常對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　3.熒光定量PCR結(jié)果表明VZV感染SHSY5Y細(xì)胞后72h的DNA拷貝數(shù)明顯高于其余三組(24h、48h、96h)(P＜0.