應(yīng)用水痘-帶狀皰疹病毒報(bào)告細(xì)胞系定量帶細(xì)胞病毒的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)ORF62表達(dá)質(zhì)粒，并應(yīng)用VZV報(bào)告細(xì)胞系MV9G定量帶細(xì)胞病毒(CAV)，以建立篩選抗VZV藥物并研究其作用機(jī)制的新方法。
　　 方法：
　　 1、以VZV疫苗株BKvOka基因組DNA為模板、PCR擴(kuò)增獲得ORF62全序列后克隆到高效表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS中構(gòu)建BKvOkaORF62表達(dá)質(zhì)粒pCAG-BKvOka62，再應(yīng)用雙酶切和DNA測(cè)序法鑒定所構(gòu)建質(zhì)粒的正確性。
　　

2、 2、將倍比稀釋的BKvOka株感染MeWo細(xì)胞(含BKvOka株CAV)與MV9G細(xì)胞共培養(yǎng)72h后，分別用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)BKvOka株CAV激發(fā)MV9G細(xì)胞表達(dá)的螢火蟲熒光素酶(RLU)、用間接免疫酶法染色并計(jì)數(shù)病毒蝕斑(focusnumbers)、用SYBRGreen熒光定量PCR法檢測(cè)病毒DNA拷貝數(shù)(DNAcopies)，分別計(jì)算RLU/病毒蝕斑數(shù)和RLU/病毒DNA拷貝數(shù)的比值，分析其相關(guān)性，并建立RLU-病毒蝕斑數(shù)、RLU

3、-病毒DNA拷貝數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)-病毒蝕斑數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在培養(yǎng)基中加入阿昔洛韋(ACV)以抑制病毒生長，再以相同方法建立ACV作用下RLU-病毒蝕斑數(shù)、RLU-病毒DNA拷貝數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)-病毒蝕斑數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　 3、將隨機(jī)稀釋的GSKvOka株感染MeWo細(xì)胞(含GSKvOka株CAV)與MV9G細(xì)胞共培養(yǎng)72h后，仍用上述方法檢測(cè)GSKvOka株CAV激發(fā)MV9G細(xì)胞表達(dá)的螢火蟲熒光素酶(RLU)、病毒蝕斑數(shù)

4、和病毒DNA拷貝數(shù)。再以MV9G細(xì)胞熒光素酶RLU為基數(shù)，根據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所得RLU/病毒蝕斑數(shù)和RLU/病毒DNA拷貝數(shù)比值推算GSKvOka株蝕斑數(shù)和DNA拷貝數(shù)，獲得病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)預(yù)測(cè)值，并將預(yù)測(cè)值與其實(shí)測(cè)值比較，以驗(yàn)證應(yīng)用MV9G細(xì)胞定量CAV的可行性。
　　 結(jié)果：
　　 1、通過將BKvOka株ORF62全序列克隆到pCAGGS表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建了VZVORF62重組表達(dá)質(zhì)粒pCAG-BKvOka6

5、2。經(jīng)雙酶切反應(yīng)和DNA測(cè)序鑒定，克隆的ORF62片段與預(yù)期一致，VZVORF62表達(dá)質(zhì)粒pCAG-BKvOka62得以成功構(gòu)建。
　　 2、將倍比稀釋的BKvOka株CAV與MV9G細(xì)胞共培養(yǎng)72h后，BKvOka株CAV激發(fā)MV9G細(xì)胞表達(dá)的熒光素酶(RLU)與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(guān)(r=0.999，P＜0.01)、與病毒DNA拷貝數(shù)顯著相關(guān)(r=0.974，P＜0.01)，病毒DNA拷貝數(shù)與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(guān)(r=0.979，

6、P＜0.01)，RLU/病毒蝕斑數(shù)=181.62，RLU/病毒DNA拷貝數(shù)=1.97×10-4。加入抗病毒藥物ACV后RLU與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(guān)(r=0.991，P＜0.01)、與病毒DNA拷貝數(shù)顯著相關(guān)(r=0.971，P＜0.01)，病毒DNA拷貝數(shù)與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(guān)(r=0.936，P＜0.05)。
　　 3、將隨機(jī)稀釋的GSKvOka株CAV與MV9G細(xì)胞共培養(yǎng)72h后，GSKvOka株CAV激發(fā)MV9G細(xì)胞表達(dá)的熒光

7、素酶(RLU)與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(guān)(r=0.992，P＜0.01)、與病毒DNA拷貝數(shù)顯著相關(guān)(r=0.988，P＜0.01)，病毒DNA拷貝數(shù)與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(guān)(r=0.966，P＜0.01)。根據(jù)GSKvOka株CAV激發(fā)MV9G細(xì)胞熒光素酶RLU值推算的病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)預(yù)測(cè)值與其實(shí)測(cè)值基本一致。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建BKvOka株ORF62表達(dá)質(zhì)粒pCAG-BKvOka62，為熒光定量PC

8、R法檢測(cè)VZVDNA提供了質(zhì)粒模板標(biāo)準(zhǔn)品，為進(jìn)一步應(yīng)用VZV報(bào)告細(xì)胞系定量CAV奠定了基礎(chǔ)。
　　 2、以已知量BKvOka株CAV與MV9G細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，無論是否加入抗病毒藥物ACV，BKvOka株CAV激發(fā)MV9G細(xì)胞表達(dá)的螢火蟲熒光素酶(RLU)與病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)均顯著相關(guān)。以未知量GSKvOka株CAV與MV9G細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)CAV激發(fā)MV9G細(xì)胞表達(dá)的熒光素酶(RLU)與病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)仍顯著相關(guān)

9、。根據(jù)RLU推算出的病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)的預(yù)測(cè)值與其實(shí)測(cè)值基本一致。提示MV9G細(xì)胞與CAV共培養(yǎng)時(shí)受CAV激發(fā)表達(dá)熒光素酶RLU的變化可以反映病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)的變化。因此，應(yīng)用MV9G細(xì)胞定量CAV是可行的。
　　 3、應(yīng)用VZV報(bào)告細(xì)胞MV9G定量CAV克服了免疫酶染色法和熒光定量PCR法過程煩瑣、難客觀、易污染等缺點(diǎn)，具有簡便、快速、敏感、客觀和高通量的特點(diǎn)，為進(jìn)一步建立抗VZV藥物篩選和作用機(jī)制研究方