優(yōu)化的外周血水痘-帶狀皰疹病毒DNA檢測方法在VZV相關(guān)疾病中的臨床應(yīng)用.pdf

1、背景和目的：水痘-帶狀皰疹病毒（varicellazoster virus,VZV）感染后可導(dǎo)致水痘、帶狀皰疹（herpeszoster,HZ）及帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛（postherpetic neuralgia,PHN）等VZV相關(guān)疾病的發(fā)生。在VZV相關(guān)疾病中對VZV DNA進行檢測，可作為感染、病毒血癥存在的依據(jù)，以及對神經(jīng)損傷程度、病情及預(yù)后作出相應(yīng)的判斷。目前國內(nèi)對于外周血 VZV DNA的檢測,通常運用實時熒光定量多聚核苷酸鏈

2、式反應(yīng)(Real-timeQuantitativepolymerasechain reaction,qPCR)檢測試劑盒。但因其價格昂貴，靈敏度不高，故在臨床中尚不能推廣。所以本文的目的之一在于優(yōu)化 DNA的提取方法，簡化標(biāo)準品的制作，設(shè)計特異性的引物，提高檢測方法的敏感性、簡單性、快速性、特異性及經(jīng)濟性。本文的另一個目的在于利用我們建立的qPCR方法，檢測VZV相關(guān)疾病外周血病毒載量的差異；利用我們建立的 qPCR方法，檢測 HZ外周

3、血單個核細胞（peripheral blood mono-nuclear cells,PBMC）、血漿病毒載量的差異性；利用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinkedimmunosorbent assay,ELISA）法，檢測VZV相關(guān)疾病神經(jīng)損傷評估因子腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、 S100B蛋白水平。
　　方法:
　　實驗一：qPCR方法檢測HZ外周

4、血患者VZV DNA的優(yōu)化選擇
　　1.隨機抽取10例HZ患者，分別利用煮沸法、離心柱法提取PBMC中DNA。
　　2.采用巢式PCR制備標(biāo)準品。
　　3.利用上海之江VZV檢測試劑盒（qPCR方法）與本文建立的方法，分別對煮沸法及離心柱法提取的DNA進行PBMC中VZV DNA的定量檢測。
　　實驗二：本文建立的qPCR方法在VZV相關(guān)疾病中的臨床應(yīng)用及檢測血漿BDNF、S100B
　　1. VZV相關(guān)疾

5、病VZV DNA載量差異性的分析：收集10例水痘、31例HZ、11例PHN及20例健康志愿者，分別設(shè)為水痘組、HZ組、PHN組及正常組，采用本文建立的qPCR方法對PBMC中VZV DNA載量進行檢測。
　　2.HZ患者治療前、后PBMC與血漿VZV DNA載量差異性的分析：在31例患者中，隨機抽取22例HZ患者，分別檢測治療前及治療14天后PBMC、血漿中的VZV DNA。
　　3.VZV相關(guān)疾病神經(jīng)損傷評估因子的分析：采

6、用ELISA法檢測水痘組、HZ組、PHN組血漿中BDNF、S100B的水平。
　　結(jié)果：實驗一：
　　1.標(biāo)準品建立：巢式PCR所建立的標(biāo)準品大小為385bp。
　　2.提取方法比較：煮沸法、離心柱法分別聯(lián)合上海之江VZV檢測試劑盒（qPCR法），VZV DNA的陽性檢出率為10％、60%。離心柱法較煮沸法檢出率高。
　　3.引物比較：離心柱法分別聯(lián)合上海之江VZV檢測試劑盒（qPCR法）和本文建立的方法陽性檢出

7、率均為60%，離心柱法下，二者陽性檢出一致。故本文建立的qPCR優(yōu)化方法為：離心柱法+巢式PCR制作標(biāo)準品+設(shè)計特異性引物。
　　實驗二：
　　1.VZV相關(guān)疾病外周血PBMC中VZV DNA陽性檢出率、載量的比較：治療前水痘組、HZ組、PHN組陽性檢出率分別為：80%、70.97%、36.36%。治療前PBMC水痘組的VZV DNA載量高于HZ組及PHN組， HZ組高于PHN組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-2.82， P<0.

8、05;Z=-2.98,P<0.05;Z=-2.47,P<0.05）。正常對照組VZV DNA檢出均為陰性。
　　2.HZ組治療前后PBMC、血漿中VZV DNA陽性檢出率、載量的比較：在HZ組隨機抽取的22例患者中，治療前PBMC、血漿中VZV DNA的陽性檢出率分別為：72.72%、63.64%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.33，df=1,P＞0.05）。治療后分別為47.06%、35.29%，無明顯的差異性（χ2=0.5，df

9、=1, P＞0.05）。治療前、后PBMC中的VZV DNA載量較血漿高，兩者有明顯的差異（Z=-4.107,P<0.05;Z=-2.432,P<0.05）。治療后PBMC、血漿中的VZV DNA載量均較治療前降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-4.11,P<0.05;Z=-3.03,P<0.05）。
　　3.VZV相關(guān)疾病血漿BDNF的比較：與正常組比較，治療前血漿BDNF水痘組、HZ組、PHN組較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（I-J=190

10、.89， P<0.05;I-J=232.49，P<0.05;I-J=246.65，P<0.05）。水痘組較HZ組、PHN組低，有明顯的差異性（I-J=-46.60，P<0.05;I-J=-55.75，P<0.05）。HZ組與PHN組無明顯的差異性（I-J=-14.15，P>0.05）。
　　4. VZV相關(guān)疾病S100B的比較：治療前血漿S100B水痘組、HZ組、PHN組均較正常組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(I-J=126.55，P<0

11、.05;I-J=164.85，P<0.05;I-J=159.94，P<0.05)，水痘組較HZ組、PHN組低，具有明顯的差異性（I-J=-38.30，P<0.05;I-J=-33.38，P<0.05)， HZ組與PHN組無明顯的差異性(I-J=4.96，P>0.05)。
　　5.HZ組血漿BDNF、S100B比較：HZ組治療前、后BDNF、S100B均較正常組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（I-J=232.50，27.38，I-J=164.

12、84，21.46，P<0.05），HZ組治療后BDNF、S100B較治療前明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（I-J=205.11，P<0.05;I-J=143.39，P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.離心柱法提取 DNA用于qPCR優(yōu)于煮沸法。
　　2.巢式PCR制作的標(biāo)準品具有更高的穩(wěn)定性。
　　3.本文建立的qPCR方法操作簡單，靈敏度高，更經(jīng)濟，可作為優(yōu)先選擇。
　　4.水痘患者PBMC中的VZV DN