宿主細胞自噬對微小隱孢子蟲入侵影響的初步研究.pdf

1、自噬是細胞維持穩(wěn)態(tài)的一種機制，自上世紀50年代由比利時科學(xué)家Christian首次發(fā)現(xiàn)后，愈發(fā)引起眾多學(xué)者的關(guān)注。自噬是細胞內(nèi)自噬小體與溶酶體結(jié)合降解自身細胞器和其他大分子的過程，它除了可以維持細胞內(nèi)成分更新外，還可以選擇性識別并清除入侵的病原微生物，在細胞與病原體相互作用的過程中發(fā)揮著重要的作用。寄生蟲是除細菌、病毒之外的一類重要病原體，蟲體刺激宿主細胞，在誘導(dǎo)和逃避宿主免疫反應(yīng)之間保持一種平衡，而宿主細胞也在感染和消除感染之間保持一

2、種平衡。目前，細胞自噬與寄生蟲感染相互作用的研究多集中在危害較為嚴重的胞內(nèi)寄生蟲如頂復(fù)門孢子綱的弓形蟲、瘧原蟲和肉足鞭毛綱的錐蟲上。對于隱孢子蟲與宿主自噬之間的相互作用研究尚屬空白。
　　本研究圍繞隱孢子蟲入侵宿主細胞這一環(huán)節(jié)，利用微小隱孢子蟲HCT-8細胞培養(yǎng)模型，初步探討了蟲體感染對宿主細胞自噬之間的相互作用關(guān)系。首先通過犢牛傳代，卵囊收集、純化、鑒定獲得微小隱孢子蟲卵囊用于體外感染實驗。通過對不同培養(yǎng)基種類、血清濃度摸索，確

3、定1640培養(yǎng)基，10％FBS條件為體外感染實驗的最優(yōu)培養(yǎng)條件。通過HE染色和DAPI染色觀察微小隱孢子蟲在HCT-8細胞上的發(fā)育特性，摸清其發(fā)育階段的各個時間節(jié)點，結(jié)合參考文獻以及我們具體的實驗條件，確定感染后3h，8h，18h作為評價其入侵率的時間節(jié)點。在優(yōu)化好的隱孢子蟲HCT-8宿主細胞體外培養(yǎng)模型基礎(chǔ)上，分別利用透射電鏡、免疫熒光、免疫印跡技術(shù)探討了微小隱孢子蟲感染對宿主細胞HCT-8自噬的激發(fā)作用。研究結(jié)果表明，微小隱孢子蟲感

4、染后宿主細胞的自噬泡數(shù)目增多，HCT-8細胞LC3Ⅱ蛋白表達量增高，HCT-8細胞的自噬水平提高。繼而建立并優(yōu)化了藥物對細胞自噬活性的預(yù)調(diào)控體系，掌握自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin,EBSS，抑制劑3-MA的最佳使用濃度或作用時間。分別通過透射電鏡，免疫熒光，免疫印跡技術(shù)研究對藥物誘導(dǎo)細胞自噬活性調(diào)控體系的作用進行驗證。通過微小隱孢子蟲對不同調(diào)控處理組細胞的入侵實驗，結(jié)合蟲體入侵評價方法計算微小隱孢子蟲對不同處理組細胞的入侵率差異，發(fā)現(xiàn)微