細胞自噬調控對兔iPSCs形成及相關基因表達的影響初步研究.pdf

1、異位表達多能性因子誘導產生多能干細胞(induced pluripotent stemcells，iPSCs)技術為體細胞重編程研究開辟了一條新的途徑，不僅可避免倫理爭議，還為干細胞及再生醫(yī)學研究提供了新的研究方法。此外，iPSCs技術也是研究基因表達調控、蛋白質相互作用、機體生長發(fā)育的重要手段。目前，有關人的iPSCs研究已經取得許多進展，但對體細胞重編程機理尚不完全了解，離應用還有一定距離，仍需利用動物模型進行更深入的研究。兔的iP

2、SCs在形態(tài)上與人iPSCs類似，這使得兔iPSCs相關研究成為關注的熱點。本研究采用四環(huán)素(Doxycycline，DOX)誘導型的慢病毒載體攜帶Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4個多能性轉錄因子，將仔兔皮膚成纖維細胞(REFs)重編程為誘導多能干細胞(RiPSCs)，并對內源多能性因子表達及細胞多能性進行分析，并利用雷帕霉素(Rapamycin)調控細胞自噬，觀察其對誘導體細胞重編程效率及相關基因表達的影響，以便為提高RiP

3、SCs重編程效率、改善RiPSCs細胞狀態(tài)奠定基礎。
　　1、兔iPSCs的誘導:通過慢病毒感染方法，將攜帶Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4個轉錄因子的病毒轉入REFs并加入DOX誘導其表達。結果發(fā)現(xiàn)，誘導2天后，細胞形態(tài)開始出現(xiàn)變化，一周后形成克隆。RiPSCs克隆邊緣整齊、折光性強、與周圍細胞界限明顯，細胞排列緊密、核質比增加。形成的RiPSCs克隆堿性磷酸酶(AP)檢測結果為陽性;RT-PCR結果顯示其表達內源性的

4、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog基因;細胞免疫熒光檢測結果表明，形成的RiPSCs克隆表達Oct4、Sox2、Stat3、Ssea1，未檢測到E-cadherin表達。挑取了約150株克隆進行傳代培養(yǎng)，有6株可傳至20代以上并保持原有的克隆形態(tài)及多能性。
　　2、細胞自噬調控對iPSCs誘導過程中相關基因表達及iPSCs形成的影響。探討了不同濃度雷帕霉素處理對REFs誘導過程中自噬相關基因表達及RiPSCs形成

5、的影響。誘導前3天添加不同濃度的雷帕霉素，待克隆形成后統(tǒng)計堿性磷酸酶(AP)陽性克隆數(shù)并觀察克隆形態(tài)。結果發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素處理的較適濃度為0.5nmol·L-1。qRT-PCR檢測結果顯示，0.5nmol·L-1雷帕霉素處理后，除了ATG5在整個誘導過程中穩(wěn)定表達之外，其余3個自噬相關基因ATG7、LC3、ULK1的表達水平在誘導過程中均有提高（P＜0.05），但升高的程度及表達時間有所不同;Oct4、Sox2、K1f4多能性基因的表達水