HCMV基因在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及病毒感染對細(xì)胞自噬的影響.pdf

1、目的:
　　1.檢測人巨絀胞病毒(human cytomegalo virus，HCMV)基因在人胚胎成纖維細(xì)胞(Human embryo fibroblast，HEF)和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryo fibroblast，MEF)中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究HCMV種屬特異性的機(jī)制奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　2.觀察HCMV感染對HEF和MEF細(xì)胞自噬的影響，為HCMV種屬特異性的研究尋找新的方向和證據(jù)。

2、>　　方法:
　　1.組織塊分離培養(yǎng)法結(jié)合膠原酶消化法分離原代HEF和MEF細(xì)胞。
　　2.在HEF細(xì)胞中擴(kuò)增HCMV AD169毒株，空斑定量法測定病毒滴度。
　　3.相差顯微鏡下觀察病毒感染(MOI=5)后HEF和MEF細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。
　　4.RT-PCR、Westem-blot、免疫熒光法檢測HCMV-IE、UL84、UL83的表達(dá)。
　　5.MTT比色法檢測HEF和MEF細(xì)胞的增殖活性。

3、　　6.單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)染色法和透射電鏡檢測胞內(nèi)自噬體。
　　7.Western-blot檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達(dá);免疫熒光法檢測LC3的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.成功分離培養(yǎng)并純化原代HEF和MEF細(xì)胞，傳代后細(xì)胞狀態(tài)良好。
　　2.用HCMV分別感染HEF和MEF細(xì)胞后，HEF細(xì)胞第2d逐漸變大變圓并相互融合，第4d超過80％細(xì)胞可見典型

4、的HCMV特征性病變效應(yīng)(CPE)，而MEF細(xì)胞在相應(yīng)時間未出現(xiàn)上述的變化。
　　3.RT-PCR和Western-blot表明HEF細(xì)胞表達(dá)HCMV-IE1、IE2、UL84和UL83 mRNA以及其編碼的蛋白，相對表達(dá)量顯著高于正常對照組(P＜0.01);而MEF細(xì)胞僅表達(dá)IE1和IE2 mRNA和蛋白，且相對表達(dá)量顯著低于HEF細(xì)胞(P＜0.05)。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCMV感染HEF細(xì)胞72 h表達(dá)IE和UL83蛋白，而ME

5、F細(xì)胞則無明顯表達(dá)。
　　4.MTT檢測顯示HCMV感染HEF細(xì)胞24 h內(nèi)，細(xì)胞增殖活性升高，24 h后隨著感染時間的延長而降低，而HCMV感染MEF細(xì)胞后，96 h內(nèi)細(xì)胞增殖活性持續(xù)升高(P＜0.05)。
　　5.MDC染色后觀察顯示HEF和MEF細(xì)胞感染后24 h，多數(shù)核周出現(xiàn)的大量藍(lán)綠色的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，24 h后HEF細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，細(xì)胞內(nèi)藍(lán)綠色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)密度減弱，而MEF細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞內(nèi)藍(lán)綠色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)密度仍

6、然逐漸增強(qiáng)，明顯高于HEF感染組。
　　6.透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)HCMV感染后HEF和MEF細(xì)胞漿內(nèi)均出現(xiàn)大量囊泡狀結(jié)構(gòu)，高倍鏡下可見雙層膜結(jié)構(gòu)，其中包含未完全降解或者已降解的細(xì)胞器等。
　　7.Western-blot結(jié)果顯示，HCMV感染HEF和MEF細(xì)胞后Beclin1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的相對表達(dá)量升高，顯著高于模擬感染組(P＜0.01);而HEF細(xì)胞在感染24 h后逐漸降低，但高于正常對照組(P＜0.01);而ME

7、F細(xì)胞24 hBeclin1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的相對表達(dá)量逐漸升高，顯著高于HEF組(P＜0.05)。免疫熒光檢測LC3蛋白結(jié)果與Western-blot結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　　1.HCMV在MEF細(xì)胞中的復(fù)制停滯在IE2基因表達(dá)之后和UL84基因表達(dá)之前的時相，不能產(chǎn)生完整的子代病毒顆粒。推斷即刻早期蛋白在MEF細(xì)胞內(nèi)的低水平表達(dá)可能與HCMV的種屬特異性相關(guān)。
　　2.HCMV感染早期誘導(dǎo)HEF和MEF細(xì)