紫外線(xiàn)致皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中的自噬研究.pdf

1、探討中波紫外線(xiàn)(ultravioletB，UVB)照射人皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的自噬對(duì)細(xì)胞凋亡活性的影響。通過(guò)單丹磺酰戊二胺(Monodansylcadaverine，MDC)染色和免疫熒光標(biāo)記微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(lightchain3，LC3)的方法，確定不同劑量3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine3-MA)對(duì)自噬的抑制作用。UVB照射后立即使用0.5mmol/L3-MA孵育細(xì)胞4h作為自噬的抑制方法。Hoechst和碘化丙啶

2、(propidiumiodide，PI)染色結(jié)合AnnexinV-異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)和PI標(biāo)記細(xì)胞后流式細(xì)胞術(shù)作為凋亡的分析方法。0.5mmol/L3-MA能明顯抑制人皮膚成纖維細(xì)胞自噬活性(饑餓誘導(dǎo)組自噬細(xì)胞陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)為63.037％±5.876％,3-MA孵育后下降至34.425％±5.183％)。0.5mmol/L3-MA對(duì)細(xì)胞活性影響最小。50mJ/cm2照射劑量下3-

3、MA孵育較未孵育細(xì)胞強(qiáng)Hoechst和強(qiáng)PI雙染細(xì)胞增多；100mJ/cm2照射劑量下3-MA孵育較未孵育細(xì)胞強(qiáng)Hoechst和強(qiáng)PI雙染細(xì)胞減少。在50mJ/cm2照射劑量下，抑制自噬的細(xì)胞的中晚期凋亡細(xì)胞百分比(10.933±0.839)較未抑制細(xì)胞(7.267±0.473)上升，兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.197，P=＜0.05)；而在100mJ/cm2照射劑量下，抑制自噬的細(xì)胞的中晚期凋亡水平(7.100±0.781)較

4、未抑制細(xì)胞(10.133±0.681)下降，兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.286，P＜0.05)。UVB誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞自噬在50mJ/cm2照射劑量下通過(guò)抑制凋亡對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用，而在100mJ/cm2照射劑量下發(fā)生的較高水平自噬可能誘導(dǎo)了自噬性細(xì)胞死亡。
　　 觀(guān)察慢性紫外線(xiàn)損傷對(duì)小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡和自噬交互調(diào)控元件Bax、Bcl-2、Beclin-1及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶．3(Caspase-3)的調(diào)

5、控效應(yīng)。采用模擬日光的UV對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行照射，設(shè)立對(duì)照。照射從最小紅斑量(UVB0.07J/cm2，長(zhǎng)波紫外線(xiàn)(ultravioletA，UVA)0.7J/cm2)開(kāi)始，1次/d，每周增加0.5個(gè)紅斑量，每周照射5天，共9周，UVB總劑量達(dá)9.45J/Cm2，UVA總劑量達(dá)94.5J/Cm2，應(yīng)用免疫組化法分別對(duì)實(shí)驗(yàn)前后（W0和W9）Bax、Bc1-2、Beclin-1和Caspase-3的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，表達(dá)強(qiáng)度以免疫反應(yīng)強(qiáng)度分布指數(shù)（

6、immunoreactivityintensitydistributionindex，IRIDI）表示。在損傷組，照光前Beclin-1、Caspase-3、Bax、Bc1-2的表達(dá)計(jì)分均值（范圍）分別為0.30(0-2)、0.25(0-2)、0.35(0-2)、0.25(0-1)，照光后計(jì)分分別為2.70(2-6)、3.30(2-9)、3.35(2-6)、0.25(0-1)。損傷組小鼠表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中Beclin-1、Caspase

7、-3、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)變化不明顯，且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。損傷組W9時(shí)Beclin-1和Bax的表達(dá)明顯高于Bc1-2(P均＜0.05)。在同時(shí)期正常飼養(yǎng)小鼠Beclin-1、Caspase-3、Bax、Bcl-2的均值（范圍）在W0為0.20(0-1)、0.20(0-1)、0.30(0-1)、0.20(0.1),W9則為0.30(0-1)、0.20(0-1)、0.

8、30(0-1)、0.10(0-1)。分析發(fā)現(xiàn)Beclin-1、Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的表達(dá)差異(P>0.05)。慢性UV損傷對(duì)小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中凋亡和自噬的交互調(diào)控元件Beclin-1和Bax具有上調(diào)表達(dá)的作用，而對(duì)另一元件Bc1-2表達(dá)調(diào)控效應(yīng)不顯著。這一系列的調(diào)控效應(yīng)可能參與了凋亡和自噬在慢性UV皮膚損傷中的交互調(diào)控。
　　 研究UVB照射對(duì)體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞自噬的調(diào)控效應(yīng)。使用由

9、低到高三種劑量照射HaCaT細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，使用透射電鏡進(jìn)行細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析，并使用蛋白免疫印跡方法進(jìn)行LC3-Ⅰ→Ⅱ型轉(zhuǎn)換分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小劑量和中等劑量的UVB照射后，細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)自噬體，并且在小劑量照射后更為多見(jiàn)；然而，當(dāng)接受了高劑量照射后，細(xì)胞中不能發(fā)現(xiàn)此類(lèi)的結(jié)構(gòu)。小劑量UVB照射后，LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)量升高；中等劑量UVB照射對(duì)LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)量沒(méi)有產(chǎn)生顯著的變化；而高劑量的UVB照射產(chǎn)生了對(duì)LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)顯著