硫酸乙酰肝素介導(dǎo)的HCMV體外感染小鼠胚胎成纖維細胞的實驗研究.pdf

1、目的：研究人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在體外增殖性感染小鼠胚胎成纖維細胞以及研究細胞表面的硫酸乙酰肝素與HCMV感染小鼠胚胎成纖維細胞的吸附過程的關(guān)系。 方法：(1)取本實驗室保存的HCMV AD169株，復(fù)蘇增殖后采用空斑形成實驗滴定病毒感染性。以MOI 100接種至BALB/c小鼠胚胎成纖維細胞(MF)和人胚胎成纖維細胞(HF)，鏡下逐日觀察HCMV特征性細胞病變效應(yīng)(CPE)并傳代三

2、次。待出現(xiàn)細胞病變后采用PCR和RT-PCR分別檢測．HCMV特異性基因IE和UL83的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。并且經(jīng)透射電鏡觀察細胞內(nèi)的病毒顆粒。同樣的培養(yǎng)物分別在感染后第1、2、3、5、7、10、14天收集細胞培養(yǎng)液，采用空斑形成試驗分別測定感染HCMV后不同時間的MF細胞和HF細胞培養(yǎng)液中的感染性病毒數(shù)量。 (2)將不同濃度的肝素和肝素酶分別與定量HCMV共同接種至已長成單層的BALB/c小鼠胚胎成纖維細胞及人胚胎成纖維細胞，采用空斑

3、形成試驗分別測定HCMV病毒感染組、肝素組和肝素酶組吸附感染細胞的病毒數(shù)量；采用RT-PCR方法檢測各組HCMV IE mRNA的表達。 結(jié)果：(1)將HCMV以MOI 100分別接種至MF細胞和HF細胞后，可觀察到MF細胞出現(xiàn)病毒所致CPE，與HF細胞上的CPE相似，表現(xiàn)為細胞腫脹變圓，胞內(nèi)顆粒增多，折光性增強。將培養(yǎng)物連續(xù)傳代三次，仍然可觀察到明顯CPE。細胞培養(yǎng)物經(jīng)PCR、RT-PCR檢測HCMV UL83、IE基因及其轉(zhuǎn)

4、錄產(chǎn)物均陽性。經(jīng)透射電鏡觀察，在MF細胞胞質(zhì)及胞核內(nèi)均可見皰疹病毒樣顆粒及病毒包涵體，病毒顆粒直徑大小不一，約為100～200nm。將HCMV以MOI 100分別接種至MF細胞和HF細胞后，連續(xù)兩周觀察其CPE。發(fā)現(xiàn)受感染的MF細胞和HF細胞在第4～5d均可見細胞腫脹變圓，胞內(nèi)顆粒增多，折光性增強；在第7d出現(xiàn)明顯廣泛的CPE；至第10d左右可見病變進一步加劇，幾乎全部細胞均已發(fā)生嚴重病變；第12～14d時，病變的細胞開始逐漸死亡脫落。

5、感染后不同時間的細胞培養(yǎng)液經(jīng)空斑形成試驗測定感染性病毒量，結(jié)果顯示MF細胞培養(yǎng)液中感染性病毒數(shù)量從第3d開始上升，為1.5×10<'3>pfu/ml；隨后不斷上升至第10d達到高峰，為1.2×10<'8>pfu/ml；第14d時隨著病變細胞的死亡脫落，細胞培養(yǎng)液中感染性病毒量下降。此結(jié)果與HF細胞培養(yǎng)液的結(jié)果基本一致。相關(guān)分析表明HF細胞培養(yǎng)液與MF細胞培養(yǎng)液兩組試驗結(jié)果呈高度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.97，P<0.01。(2)肝素與肝素酶

6、抑制HCMV的空斑形成試驗結(jié)果可見，與病毒感染組相比，肝素組與肝素酶組HCMV在MF細胞上形成的PFU明顯減少，且肝素與肝素酶濃度越高PFU減少越明顯，具有劑量依賴性。HCMV IE基因的RT－PCR檢測結(jié)果，經(jīng)Bioscience imageanlysis system 進行灰度值分析顯示，肝素組和肝素酶組MF細胞 HCMV IE 基因相對表達水平較病毒感染組細胞降低，差異有顯著性(P<0.01)。 結(jié)論：證實了HCMV在體外