小鼠胚胎成纖維細胞直接重編程為心肌細胞的探討.pdf

1、目的：
　　將終末分化的成纖維細胞直接定向誘導為心肌細胞，為心肌細胞再生提供一種新思路。
　　方法：
　　首先構建慢病毒載體，載體成功構建后使用慢病毒將Gata4、Tbx5及Mef-2c三種轉錄因子轉染至小鼠胚胎成纖維細胞中,以及添加促進干細胞分化的小分子物質丙戊酸鈉（VPA）與維生素C（VitC），轉染后培養(yǎng)21天，采用免疫熒光染色、RT-PCR、Western Blot等方法對轉染后的細胞從基因表達水平和蛋白表達水

2、平，檢測其定向分化為心肌細胞的效率。
　　結果：
　　細胞免疫熒光結果顯示轉染后7天、14天、21天均未見心肌特異性蛋白cardiac-TroponinT、α-MHC及α-actnin的表達。添加小分子物質VPA、VitC后培養(yǎng)7天、14天、21天后的細胞也無出現(xiàn)心肌特異性蛋白cardiac-TroponinT、α-MHC及α-actnin的表達，更未出現(xiàn)自發(fā)跳動的細胞。我們采用RT-PCR來檢測心肌標志基因的表達情況。檢測

3、結果顯示心肌標志基因TNNI3（cTnI）、Actn2(α-actinin)表達方面：單用Gata4、Mef-2c及Tbx-5組，以及Gata4、Mef-2c及Tbx-5三種轉染因子共同作用的GMT組，TNNI3、Actn2的表達雖然比成纖維細胞陰性對照組略微增高，但遠遠不及小鼠心肌細胞陽性對照組。添加小分子物質VPA、VitC組別與GMT組相比，TNNI3、Actn2基因表達無明顯升高，作用不明顯。通過 Western Blot實驗結

4、果表明，檢測慢病毒轉染誘導成纖維細胞直接重編程為心肌細胞，以及添加小分子物質VPA、VitC增加轉染效率后，均沒有特異性心肌蛋白的表達。
　　結論：
　　本實驗提示，從轉錄后基因表達水平、蛋白表達水平都證實，小鼠胚胎成纖維細胞在Gata4、Mef-2c、Tbx5這三種轉錄因子作用下定向向心肌細胞分化的實驗研究方面，效率低下。在我們添加能促進胚胎干細胞分化的小分子物質VPA以及VitC之后，也未能使其效率有所提高。在探討心肌細