小鼠胚胎成纖維細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、多潛能干細(xì)胞(pluripotentstemcells)是指能夠自我更新并具有分化成多種細(xì)胞潛能的細(xì)胞，它在細(xì)胞替代治療、基因治療、發(fā)育生物學(xué)等研究中具有獨(dú)特的作用及優(yōu)越性。目前，最為人類所熟知的多潛能性干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells，ES細(xì)胞)，它一般是從囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)而產(chǎn)生，也可通過體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移或細(xì)胞融合等途徑得到多潛能性干細(xì)胞。然而胚胎干細(xì)胞的研究，尤其是人胚胎干細(xì)胞，都需要破壞胚胎或卵細(xì)胞

2、，引發(fā)諸多倫理爭議，應(yīng)用于臨床時還將面臨免疫排斥等問題。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，iPS細(xì)胞)的出現(xiàn)為解決上述難題提供了希望。與ESCs相比，iPS細(xì)胞有其獨(dú)到的優(yōu)勢:①iPS由體細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，不存在ESCs面臨的倫理問題;②iPS細(xì)胞來源廣泛，iPS可來自患者體細(xì)胞(包括病變體細(xì)胞)，經(jīng)過克隆增殖分化可滿足臨床移植治療數(shù)量上的要求;③來自患者的iPS避免了一直困擾再生醫(yī)學(xué)界的免疫排斥難題

3、。因此自iPS技術(shù)誕生以來，其在誘導(dǎo)效率、安全性及臨床應(yīng)用等相關(guān)研究中取得了巨大的進(jìn)展。本研究利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的方法將三個干細(xì)胞因子Oct4、Sox2、Klf4導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouseembryonicfibroblasts，MEFs)，成功獲得了小鼠iPS細(xì)胞，并對其干細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)及全能性進(jìn)行了分析鑒定。
　　 目的:
　　 1.利用Yamanaka三因子(Oct4、Sox2、Klf4)構(gòu)建小鼠誘導(dǎo)性多能

4、干細(xì)胞系。
　　 2.對所獲得的iPS細(xì)胞進(jìn)行鑒定及全能性分析，以期獲得與胚胎干細(xì)胞類似的多能干細(xì)胞，為本課題后續(xù)將iPS細(xì)胞進(jìn)一步定向分化為胰島樣細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和技術(shù)平臺。
　　 方法:
　　 1.逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備:包含Oct4，Sox2和Klf4三個基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pMXs-Oct3、pMXs-Sox2、pMXs-Klf4及參照質(zhì)粒pMXs-EGFP由Addgene公司購買，使用DH5α細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增后將

5、4個質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞Plat-E，48h后收集病毒上清，過濾、濃縮后用于感染MEFs。
　　 2.鼠胚成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng):無菌分離孕13.5d的BALB/C鼠胚，消化后接種至平皿培養(yǎng)。1-3代內(nèi)的細(xì)胞用于iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)。
　　 3.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染MEF及iPS細(xì)胞的產(chǎn)生:將收集的病毒上清感染生長良好的MEFs，約1周時可首次看到iPS克隆，20d左右iPS克隆可長至做夠大被挑取擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　

6、 4.iPS細(xì)胞的生物學(xué)特性鑒定:通過鏡下觀察、堿性磷酸酶染色、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)及畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)等對iPS細(xì)胞形態(tài)、多能性基因表達(dá)情況、干細(xì)胞表面標(biāo)記及全能性等進(jìn)行鑒定分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備:逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Plat-E細(xì)胞48h后，熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達(dá)(pMXs-EGFP)，轉(zhuǎn)染效率約在50-70％之間，細(xì)胞狀態(tài)良好。
　　 2.鼠胚成纖維細(xì)胞的分

7、離與培養(yǎng):MEFs原代培養(yǎng)在接種后3-4h貼壁，細(xì)胞呈長梭形、多邊形或不規(guī)則形，中間1-2個圓形或卵圓形的核，原代MEF雜細(xì)胞較多，隨著傳代次數(shù)的增多，其純度增高，一般第二代后即可得到較純的細(xì)胞。
　　 3.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染MEFs及iPS細(xì)胞的產(chǎn)生:包含三個干細(xì)胞基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染MEFs后大約一周左右可以在鏡下首次看到iPS克隆，而后克隆繼續(xù)增殖，12d左右形成肉眼可見的iPS集落，16-20d時克隆長至足夠大，此時進(jìn)行挑取

8、、消化、接種至飼細(xì)胞上傳代培養(yǎng)。
　　 4.iPS細(xì)胞的生物學(xué)特性鑒定:從MEFs獲得的iPSCs鏡下觀察呈典型的克隆狀生長，圓形或橢圓形，與飼細(xì)胞分界清楚;RT-PCR、堿性磷酸酶染色及免疫熒光檢測iPS細(xì)胞高表達(dá)胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因及蛋白;種植在免疫缺陷鼠體內(nèi)能夠形成向內(nèi)中外三個胚層分化的畸胎瘤，表明iPSCs具有多潛能性。未感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的MEFs不具有上述ES相關(guān)的細(xì)胞特性。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過轉(zhuǎn)