誘導(dǎo)小鼠胎兒成纖維細(xì)胞為多能干細(xì)胞的共孵育方法研究.pdf

1、本試驗(yàn)將完全分化的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(MEFs)經(jīng)滲透化處理后與小鼠類胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)裂解液共孵育,建立共孵育重編程逆轉(zhuǎn)化方法,探討誘導(dǎo)MEFs逆轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞的可能性。重點(diǎn)研究了小鼠類ES細(xì)胞的裂解方法及裂解液的有效提取方式、在裂解液中添加不同物質(zhì)組成共孵育逆轉(zhuǎn)化配方、MEFs的滲透化處理方法和MEFs在不同的共孵育體系中人工誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞的效果等,旨在構(gòu)建新的共孵育重編程逆轉(zhuǎn)化體系提高人工誘導(dǎo)MEFs為多能干細(xì)胞的效

2、率。
　　 試驗(yàn)一:共孵育重編程逆轉(zhuǎn)化體系中小鼠類ES細(xì)胞的有效生成途徑及其影響因素研究
　　 以昆明系小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,采集妊娠3.5d、4d和4.5d的胚胎,分別移入DMEM培養(yǎng)液、DMEM+白血病抑制因子(UF)和MEFs共培養(yǎng)體系中進(jìn)行培養(yǎng),比較內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)從透明帶內(nèi)孵出的時(shí)間、孵化囊胚的貼壁情況以及ICM集落的形成情況,旨在篩選獲取優(yōu)質(zhì)ICM集落的試驗(yàn)方法,為進(jìn)一步有效分離、培養(yǎng)和鑒定類ES細(xì)胞并用于后續(xù)試

3、驗(yàn)的裂解過(guò)程奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明:妊娠3.5d的胚胎有61%為桑葚胚,需要經(jīng)過(guò)4～5d的體外培養(yǎng)才能形成ICM集落,妊娠4d的擴(kuò)張囊胚經(jīng)過(guò)3～4d的共培養(yǎng)后形成ICM集落,妊娠4.5d的孵化囊胚經(jīng)過(guò)1～2d的共培養(yǎng)即可形成ICM集落;ICM集落形成率差異極顯著(P＜0.01),妊娠4.5d的胚胎ICM集落形成率最高,其次為妊娠4d的胚胎,但妊娠4.5d沖出孵化囊胚數(shù)量明顯減少;MEFs共培養(yǎng)體系優(yōu)于DMEM和DMEM+LIF培養(yǎng)體系。因此

4、,采集妊娠4d的昆明小鼠胚胎,選擇MEFs共培養(yǎng)體系,在體外培養(yǎng)3～4d,能夠有效地分離培養(yǎng)出可用于ES細(xì)胞研究的優(yōu)質(zhì)ICM集落。
　　 試驗(yàn)二:昆明小鼠類ES細(xì)胞裂解液的生成及其無(wú)細(xì)胞共孵育培養(yǎng)體系研究
　　 選取優(yōu)質(zhì)ICM集落進(jìn)行傳代培養(yǎng)得到類ES細(xì)胞集落,采用液氮凍融細(xì)胞法和顯微計(jì)數(shù)細(xì)胞消失法,將類ES細(xì)胞分別在液氮中凍融3次、5次、7次和9次,比較不同試驗(yàn)組尚存完整細(xì)胞的個(gè)數(shù),旨在探討能夠使類ES細(xì)胞完全裂解且細(xì)

5、胞內(nèi)人分子物質(zhì)較少受到破壞的凍融臨界次數(shù),以便獲得能夠保持較多干細(xì)胞生理活性物質(zhì)特性的無(wú)細(xì)胞共孵育培養(yǎng)體系。結(jié)果表明:類ES細(xì)胞裂解3次的完整細(xì)胞數(shù)與裂解5次、7次、9次差異極顯著(P＜0.01),裂解3次類ES細(xì)胞并未完全被破壞,還含有很多完整細(xì)胞,類ES細(xì)胞裂解5次、7次、9次完整細(xì)胞數(shù)差異不顯著(P＞0.05),類。ES細(xì)胞集落裂解5次仍有完整細(xì)胞,裂解7次、9次無(wú)完整細(xì)胞。因此,選取液氮反復(fù)處理7次的類ES細(xì)胞裂解液用于MEFs

6、重編程的無(wú)細(xì)胞共孵育培養(yǎng)體系比較合適。
　　 試驗(yàn)三:共孵育重編程逆轉(zhuǎn)化體系中MEFs的優(yōu)化選擇和滲透化處理方式研究
　　 以昆明系小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,采集妊娠13.5d的小鼠胚胎,分離培養(yǎng)MEFs并將其傳至第3代,選擇不同濃度鏈球菌溶血素O(SLO)影響MEFs細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,探討增加MEFs細(xì)胞膜滲透性并能通過(guò)較大生理活性物質(zhì)的滲透化處理方法。試驗(yàn)分別采用0.1U·μL-1、0.25U·μL-1、0.5U·μL-1、1U

7、·μL-1SLO處理MEFs,然后在顯微鏡下觀察并記錄死亡細(xì)胞數(shù),旨在篩選滲透化處理MEFs的適宜SLO濃度。結(jié)果表明:經(jīng)0.5U·μL-1、1U·μL-1SLO處理的MEFs死亡細(xì)胞數(shù)較多,影響MEFs逆轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞的效率;經(jīng)0.1U·μL-1、0.25U·μL-1的SLO處理的MEFs死亡細(xì)胞數(shù)較少,且兩處理組差異不顯著(P＞0.05),考慮劍SLO的濃度過(guò)低很可能造成MEFs滲透化處理不完全,最終影響MEFs的逆轉(zhuǎn)化效率。因此

8、,選取0.25U·μL-1的SLO作用于MEFs既有望得到較好的滲透化處理效果,又可以盡量不破壞MEFs,為進(jìn)一步研究MEFs和類ES細(xì)胞裂解液共孵育重編程體系奠定基礎(chǔ)。
　　 試驗(yàn)四:不同的類ES細(xì)胞裂解液共孵育培養(yǎng)體系誘導(dǎo)MEFs逆轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞的效果觀察
　　 將經(jīng)過(guò)SLO預(yù)處理的MEFs分別移入類ES細(xì)胞裂解液組(Ⅰ組)、曲古抑菌素(TSA)和SLO預(yù)處理MEFs+類ES細(xì)胞裂解液處理組(Ⅱ組)、5.氮脫氧胞苷

9、酸(5-Aza-dC)和SLO預(yù)處理MEFs+類ES細(xì)胞裂解液處理組(Ⅲ組)、TSA+5-Aza-dC和SLO預(yù)處理MEFs+類ES細(xì)胞裂解液(Ⅳ組)四組共孵育逆轉(zhuǎn)化體系中作用,并與無(wú)裂解液組作對(duì)照,對(duì)MEFs的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行觀察,并對(duì)重編程逆轉(zhuǎn)化所得多能干細(xì)胞進(jìn)行鑒定,研究不同的類ES細(xì)胞裂解液共孵育培養(yǎng)體系誘導(dǎo)MEFs逆轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞的效果,確定能夠有效誘導(dǎo)MEFs為多能干細(xì)胞的共孵育方法。結(jié)果顯示:試驗(yàn)Ⅳ組的非圓形細(xì)胞個(gè)數(shù)與共孵

10、育方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間差異極顯著(P＜0.01),試驗(yàn)Ⅳ組類ES細(xì)胞集落個(gè)數(shù)明顯優(yōu)于其它三個(gè)處理組(P＜0.01)。因此,在類ES細(xì)胞裂解液共孵育前使用TSA和5-Aza-dC兩種物質(zhì)預(yù)先處理MEFs更有利于提高M(jìn)EFs逆轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞的效率。
　　 結(jié)論:采集妊娠4d的昆明小鼠胚胎,與MEFs共培養(yǎng)3～4d,能夠獲取分離培養(yǎng)類ES細(xì)胞的優(yōu)質(zhì)ICM,采用液氮反復(fù)凍融方法處理類ES細(xì)胞7次,能夠獲得物理方法凍融破壞比較完全的類E