人體細(xì)胞體外重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞關(guān)鍵技術(shù)的研究.pdf

1、目的：本研究將攜帶胚胎特異性轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因慢病毒顆粒感染人包皮成纖維細(xì)胞(Human postnatal foreskin fibroblastshPFF),體外重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcelliPSC);原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVE)體系,將表達(dá)microRNA-302

2、-367基因慢病毒顆粒感染HUVE,探討目的基因microRNA-302-367過(guò)表達(dá)慢病毒顆粒感染HUVE體外重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell iPSC)的關(guān)鍵技術(shù)。
　　方法：(1)以最佳病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI值)感染hPFF,體外重編程為iPSC,通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、堿性磷酸酶染色進(jìn)行驗(yàn)證及畸胎瘤成瘤實(shí)驗(yàn)對(duì)iPSC多向分化潛能進(jìn)

3、行鑒定(2)采用0.1％Ⅰ型膠原酶灌注人臍靜脈,消化15min后收集人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液,接種于T25cm的培養(yǎng)瓶中,進(jìn)行培養(yǎng)。以免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行細(xì)胞鑒定;MTS法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。(3)將過(guò)表達(dá)綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的空病毒顆粒感染HUVE,在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況,探討最佳感染條件及MOI值;(4)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HUVE隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組、含綠色熒光蛋白空病毒載

4、體感染組、目的基因感染組進(jìn)行感染,第2天給予干細(xì)胞培養(yǎng)條件,在倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化,探討最佳培養(yǎng)條件。
　　結(jié)果：(1)在最佳MOI值40的慢病毒感染條件下感染hPFF,感染7天后,細(xì)胞偽足收縮,形態(tài)由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形,感染25天后,可挑選細(xì)胞克隆;堿性磷酸酶染色為陽(yáng)性;畸胎瘤成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)iPSC具有向內(nèi)、中、外三個(gè)胚層分化的潛能(2)0.1%Ⅰ型膠原酶消化人臍靜脈體外建立穩(wěn)定的HUVE系,培養(yǎng)3天后,0.25%胰蛋白酶